[发明专利]一种基于人工囊泡的分子信标原位检测冠状病毒核酸的方法

说明书

本发明公开用于检测冠状病毒核酸的人工囊泡及分子信标。本发明通过构建可与冠状病毒发生融合的人工囊泡，利用与冠状病毒核酸特异性结合的分子信标，实现了无需提取和扩增病毒核酸，即可快速原位检测冠状病毒，具有检测方便快捷的优点。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及检测冠状病毒核酸的方法。

背景技术

冠状病毒是一类有包膜的单股正链RNA病毒，基因组大约在27-32kb之间。2019年爆发的新型冠状病毒(SARS-COV-2)疫情，感染病毒的人会出现程度不同的症状，如发烧或轻微咳嗽，发展为肺炎，更为严重甚至死亡。

SARS-CoV-2属于冠状病毒亚科β属，具有较强的传染性。核酸检测在新冠肺炎疫情防控中起着重要作用。目前SARS-COV-2核酸检测方法主要包括PCR技术、等温扩增技术和基因测序技术。虽然核酸PCR检测方法特异性强，灵敏性高，但仍存在假阴性高、检测时间长(包括提取、扩增和检测)等问题。因此，除了常规的PCR定量检测方法，一些新的基于核酸检测的方法被开发出来。张锋研究团队使用合成的新型冠状病毒RNA片段，设计了两个可识别新型冠状病毒特征的向导RNA：一种识别新冠病毒的S基因，另一种识别Orf1ab基因。当与Cas13蛋白结合时，它们可形成一个SHERLOCK系统，检测病毒RNA的存在。该方法可准确检测20～200aM的病毒靶序列(每微升10～100个拷贝)，并可在1个小时内完成。YIN等利用逆转录环介导等温扩增技术检测新冠病毒的ORFlab基因，在65度恒温条件下检测限可低至10个拷贝，灵敏性达97.6％，检测时间15-40 min(Julia Joung,Alim Ladha,Makoto Saito,Feng Zhang.Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot Testing,N Engl JMed.,2020,383(15):1492-1494；YU L,ZHOU L,LIU H.Rapid colorimetric detection ofCOVID-19coronavirus using a reverse transcriptional loop-mediated isothermalamplification(RT-LAMP)diagnostic platform:iLACO[J].Clinical Chemistry,2020,3(12):4-10)。

血管紧张素转换酶2(Angiotensin Converting Enzyme，ACE2)蛋白是SARS-CoV-2的受体，SARS-CoV-2可以通过其表面的S蛋白与宿主细胞的ACE2蛋白相结合，进而感染宿主细胞。细胞表面的丝氨酸蛋白酶TMPRSS2激活了S蛋白，S1亚基与受体细胞表面的ACE2受体结合，随后S2亚基使病毒与细胞的膜融合，帮助病毒进入细胞。

分子信标(Molecular Beacon，MB)是基于荧光共振能量转移原理的一种荧光标记核酸探针，具有特异识别性强、灵敏度高、实时、操作简单等特点，已经广泛应用到细菌性传染病和病毒性传染病的诊断。分子信标由环部序列和两侧反向互补的茎序列组成，两端分别被荧光基团和淬灭基团修饰。当病毒存在时，分子信标的发卡结构打开，病毒序列与分子信标的环部序列相结合，荧光基团分子与淬灭基团距离增大，释放荧光，且分子信标的荧光强度与病毒核酸含量成正比。

基于上述原因，有必要针对冠状病毒研制出一种基于分子信标的免提取原位快速检测方法。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种基于人工囊泡的分子信标原位检测冠状病毒核酸(如2019新型冠状病毒SARS-COV-2)的方法。本发明无需病毒核酸提取、RNA反转录和PCR扩增等环节，只需利用含特异性分子信标的人工囊泡，与病毒发生融合，采用流式细胞术检测分子信标与病毒核酸结合后释放的荧光信号，即可实现快速原位免提取的检测冠状病毒。本方法与传统的PCR方法相比，无需提取核酸和反转录，操作简便。