[发明专利]一种滴斗式的步移引物及基于滴斗式引物的PCR新方法

说明书

本发明涉及分子PCR步移技术领域，具体为一种滴斗式的步移引物及基于滴斗式引物的PCR新方法，其中步移引物包括三条滴斗引物DBP，长度均为25bp，三者5′端12bp、3′端3bp完全相同，中间10bp两两错配，滴斗引物只能在低温下退火到前一轮产物的滴斗互补位点，形成滴斗结构，并延伸合成新的含特异性引物互补位点的目标单链；在随后的一个高退火循环中，目标单链转变为两端分别被特异性引物和滴斗引物包围的双链分子，从而被指数扩增；非目标单链由于缺乏任何引物的完整退火位点，不能转变为被任何引物包围的双链而无法扩增。本发明通过步移获取短乳杆菌CD0817和水稻基因组已知DNA的未知侧翼，验证了该方法的可行性。

技术领域

本发明涉及分子PCR步移技术领域，具体为一种滴斗式的步移引物及基于滴斗式引物的PCR新方法。

背景技术

基因组步移是一种重要的分子生物学技术，常用来获取目的基因的全长序列，克隆与已知序列毗邻的侧翼未知序列。基因组步移技术主要应用于以下几个方面：(1)获取调控基因，用于研究结构基因的表达调控；(2)步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；(3)鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点；(4)染色体测序工作中的空隙填补，以获得完整的基因组序列；(5)人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接；(6)发现新的功能基因和菌种筛选。基因组步移已成为获取自然界大多生物未知基因组序列中已知序列侧翼的重要手段。

分离侧翼序列的基因组步移方法主要有：(1)基于基因组文库筛选的基因组步移技术；(2)基于PCR的基因组步移技术。基于PCR方法的按原理可分为：依赖于酶切连接介导的PCR方法，如反向PCR，载体PCR等；随机引发PCR，如热不对称交错PCR，半随机引物PCR。上述方法虽成功扩增出侧翼序列，但存在操作过程繁琐，特异性扩增效果差，连接效率低等弊端。针对上述问题，本发明提出一种滴斗式的步移引物及基于滴斗式引物的PCR新方法，减少基因组步移过程中产生的非特异性目标产物，提高扩增效率。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种滴斗式的步移引物及基于滴斗式引物的PCR新方法，解决了现有分离侧翼序列的基因组步移扩增方法存在操作过程繁琐，特异性扩增效果差，连接效率低等弊端的问题。

(二)技术方案

本发明提出一种滴斗式的步移引物及基于滴斗式引物的PCR新方法，基于步移引物错配获取已知序列未知侧翼，可减少基因组步移过程中产生的非特异性目标产物，提高扩增效率。

为实现上述目的，本发明提供一种滴斗式的步移引物，其特征在于：所述步移引物包括三条滴斗引物DBP1、DBP2、DBP3，引物的长度均为25bp，两两之间的5′端12bp、3′端3bp完全相同，中间10bp完全不同。

优选的，所述滴斗引物之间仅在低温下才能相互退火，滴斗引物之间退火温度为35-40℃。

优选的，所述PCR新方法包括三个三轮巢式PCR反应扩增程序，每轮PCR分别利用一条滴斗引物和一条特异性引物配对进行扩增，三轮巢式PCR中依次使用三条滴斗引物，第一轮PCR以基因组为模板、第二和第三轮反应以前一轮PCR产物为模板，连续进行三轮巢式PCR，不同滴斗引物组合中的三条引物依次分别与SP1、SP2、SP3配套使用，构成三组平行反应。

优选的，所述特异性引物是根据短乳杆菌CD0817的谷氨酸脱羧酶基因、水稻基因组中潮霉素基因的DNA序列设计2组基因特异性引物SP，每组包括3条巢式特异性引物SP1、SP2、SP3，分别应用于第1轮、第2轮、第3轮，特异性引物长度与滴斗引物长度一致，且退火温度相近。