[发明专利]一种滴斗式的步移引物及基于滴斗式引物的PCR新方法

权利要求书

1.一种滴斗式的步移引物，其特征在于：所述步移引物包括三条滴斗引物DBP1、DBP2、DBP3，引物的长度均为25bp，两两之间的5′端12bp、3′端3bp完全相同，中间10bp完全不同。

2.根据权利要求1所述的一种滴斗式的步移引物，其特征在于：所述滴斗引物之间仅在低温下才能相互退火，退火温度为35-40℃。

3.一种基于滴斗式引物的PCR新方法，其特征在于：所述PCR新方法包括三轮巢式PCR反应，每轮PCR由一条滴斗引物和对应该轮次的特异性引物驱动，三条滴斗引物按不同使用顺序形成三种不同组合，第一轮PCR以基因组为模板，第二和第三轮反应以前一轮PCR产物为模板，连续进行三轮巢式PCR，不同滴斗引物组合中的三条引物依次分别与特异性引物SP1、SP2、SP3配套使用，构成三组平行反应。

4.根据权利要求3所述PCR新方法，其特征在于：所述特异性引物是根据短乳杆菌CD0817的谷氨酸脱羧酶基因、水稻基因组中潮霉素基因的DNA序列设计2组基因特异性引物SP，每组包括3条巢式特异性引物SP1、SP2、SP3，分别应用于第1轮、第2轮、第3轮PCR，特异性引物长度与滴斗引物长度一致，且退火温度相近。

5.根据权利要求3所述PCR新方法，其特征在于：所述滴斗引物的序列如序列表中SEQID NO:1～SEQ ID NO:3所示，特异性引物的序列如序列表中SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:9所示，第一轮PCR的引物组合为SP1-DBP1-DBP2-DBP3，第二轮PCR的引物组合为SP2-DBP2-DBP3-DBP1，第二轮PCR的引物组合为SP3-DBP3-DBP1-DBP2。

6.根据权利要求3所述PCR反应，其特征在于：所述PCR反应扩增程序包括以下步骤：

第一轮PCR：①94℃变性3min，②5个65℃高严谨循环：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min，③1个25℃极低严谨循环：94℃变性30s，25℃退火30s，72℃延伸2min；④25个65℃高严谨循环：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min，⑤72℃延伸10min；

第二轮PCR：①94℃变性3min，②5个65℃高严谨循环：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min，③1个40℃低严谨循环：94℃变性30s，40℃退火30s，72℃延伸2min；④25个65℃高严谨循环：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min，⑤72℃延伸2min；

第三轮PCR：扩增条件与第二轮一致。

7.根据权利要求6所述PCR反应扩增程序，其特征在于：所述第一轮PCR反应体系包括：1×Mg²⁺plus LA PCR BufferⅡ，1.6mM dNTP Mixture，模板DNA，其中10-100ng短乳杆菌CD0817基因组DNA，100-1000ng水稻基因组DNA，0.2μM滴斗引物，0.2μMSP1引物，2.5UTaKaRa LA Taq，加无菌蒸馏水补足体积至50μL。

8.根据权利要求6所述PCR反应扩增程序，其特征在于：所述第二轮PCR反应体系包括：1×Mg²⁺plus LA PCR BufferⅡ，1.6mM dNTP Mixture，1μL第一轮PCR扩增产物，0.2μM与第一轮不同的任一滴斗引物，0.2μM SP2引物，2.5U TaKaRa LA Taq，加无菌蒸馏水补足体积至50μL。

9.根据权利要求6所述PCR反应扩增程序，其特征在于：所述第三轮PCR反应体系包括：1×Mg²⁺plus LA PCR BufferⅡ，1.6mM dNTP Mixture，1μL第二轮PCR扩增产物，0.2μM与前两轮不同的滴斗引物，0.2μM SP3引物，2.5U TaKaRa LA Taq，加无菌蒸馏水补足体积至50μL。