[发明专利]生成哑铃形DNA载体的方法

说明书

哑铃形DNA最小载体代表仅由感兴趣的基因表达盒和末端闭合环结构组成的遗传载体。用于小发夹RNA或microRNA表达的哑铃载体体积非常小，这对于细胞传递和核扩散是有利的。用于生成表达小RNA的哑铃载体的常规策略需要克隆相应的质粒载体，该载体随后用于哑铃保护。在这里，我们提出了一种新的无克隆方法，用于生成表达小RNA的哑铃载体，该载体也不需要任何限制性内切酶。该方法包括使用含有感兴趣序列的有义或反义链的引物对通用DNA模板进行PCR扩增，将扩增产物变性和重折叠以形成茎环结构，并使用DNA连接酶将结构共价闭合以获得哑铃结构。

技术领域

本公开涉及一种新的通用模板辅助无克隆方法，该方法允许以低成本有效合成哑铃形DNA载体，用于将重组DNA和RNA递送到宿主细胞中。

背景技术

遗传性和获得性遗传疾病的基因治疗、基因疫苗接种、干细胞编程、体细胞重编程、免疫治疗、CRISPR/Cas介导的基因组编辑和体内蛋白质表达操作等方法的效率依赖于将重组DNA递送到离体或体内的原代细胞中，以触发非编码RNA或蛋白质的表达。

在原代细胞中，重组外源游离DNA(如质粒)的表达在递送后24小时内被沉默，与递送途径无关。这种影响背后的机制知之甚少。只有整合病毒传递载体，如逆转录病毒、慢病毒和AAV载体，已成功用于触发原代细胞的中长期表达。然而，考虑到当前的良好生产规范(cGMP)生产标准，这些载体的成本很高。在cGMP标准下生产病毒载体被认为比生产等量的“裸露”遗传物质要贵几个数量级。此外，病毒载体存在安全风险和担忧，这些风险和担忧与(i)和整合位点的整合外源DNA的负面干扰有关(例如破坏基因功能和调控)，以及(ii)涉及源自致病病毒的成分。

或者，将功能性RNA直接递送到原代细胞会导致快速降解并仅提供短期影响。因此，强烈希望开发能够逃避转基因沉默的新型遗传载体。

新型载体，如仅由包含启动子、编码基因和RNA稳定序列的转录单位组成的DNA小环或哑铃形载体，由于体积小而具有若干优点，例如改善细胞递送或核扩散。此外，由于共价闭合结构，这些小载体对核酸外切酶具有抗性，而质粒通常具有由剪切力触发的单链断裂，即所谓的切口。不需要的细菌序列或抗性蛋白的缺乏消除了宿主中不需要的副作用，以及受控的体外合成和将荧光团、细胞穿透肽、抗体、适体、糖或免疫刺激肽化学连接到环结构的选择，允许轻松操作这些载体。

如上所述，质粒中的转基因沉默是常见的。在转基因表达盒的5’和3’末端之间缺乏基因外间隔的DNA小环被证明允许在小鼠中持续表达转基因。与小圆相比，哑铃形载体的分子量可以小一个数量级，尤其是那些用于表达小非编码RNA的载体。WO2012/032114公开了包含哑铃形环状载体的DNA表达构建体，该载体在注射入黑素瘤后7天保持表达。与传统载体的生产相比，哑铃形载体的合成通常复杂且成本高。最先进的技术通常依赖于酶，并且还需要克隆和化学合成。尽管已经对方法进行了改进，例如在US2008/0153763中公开的利用基于PCR的技术合成哑铃载体，但这些方法仍然很大程度上依赖于克隆和限制性内切酶，使得哑铃形载体的生产成本很高。