[发明专利]生成哑铃形DNA载体的方法

权利要求书

1.一种生成哑铃形载体的无克隆和无核酸内切酶的方法，所述哑铃形载体包含发夹结构的表达盒，所述方法包括：

i)提供包含单链核酸模板的制剂，所述单链核酸模板包含靶核酸分子，所述靶核酸分子包含两个互补序列区段，其中每个区段包含转录启动子序列并且进一步包含转录终止子，并且其中所述两个互补序列区段由第三序列区段隔开；

ii)提供其中所述单链核酸模板额外包含茎的制剂；

iii)使所述单链核酸模板与包含3’-羟基的第一寡核苷酸引物接触，所述第一寡核苷酸引物与所述单链核酸模板的3’末端核苷酸序列的至少部分互补，并且进一步包含与所述靶核酸分子不互补的5’核苷酸序列，其中所述寡核苷酸引物包含编码发夹结构RNA的3’臂的序列；并且进一步使所述单链核酸模板与第一阻断寡核苷酸接触，所述第一阻断寡核苷酸与所述单链核酸模板的5’末端核苷酸序列的至少部分互补；

iv)提供聚合酶链反应组分以对3’退火的第一寡核苷酸引物进行引物延伸；

v)使所述延伸的寡核苷酸引物与包含3’-羟基的第二寡核苷酸引物接触，所述第二寡核苷酸引物与所述延伸的寡核苷酸引物的3’末端核苷酸序列的至少部分互补并且进一步包含与所述靶核酸分子不互补的5’核苷酸序列，其中所述寡核苷酸引物包含编码发夹结构RNA的3’臂的序列；并且进一步使所述单链核酸模板与第二阻断寡核苷酸接触，所述第二阻断寡核苷酸与所述延伸的寡核苷酸引物的5’末端核苷酸序列的至少部分互补；

vi)将所述模板进行聚合酶链扩增以合成模板DNA的池并将所述模板退火以生成双链核酸，所述双链核酸在正链和负链的5’核苷酸序列处包含编码发夹结构RNA的3’臂的序列，并且在正链和负链的3’核苷酸序列处包含编码发夹结构RNA的5’臂的序列；

vii)使所述双链核酸热变性，然后冷却以允许所得正链和负链DNA的分子内重新折叠，以建立由正链或负链DNA组成的预形成的寡聚茎环结构；

viii)将正链和负链DNA的所述预形成的寡聚环结构与单链特异性DNA连接酶接触以在分子内连接中将末端5’-磷酸化的5’突出端与相同DNA链的3’突出端的末端3’-OH基团连接，以建立共价闭合的正链衍生和负链衍生的哑铃形载体DNA，其包含发夹结构的模板DNA，用于发夹结构RNA的转录；

ix)将所述哑铃形载体DNA与DNA核酸外切酶接触，以去除所有引物和含有5’和3’端的非共价闭合DNA。