[发明专利]生物分子的标记

说明书

可逆地标记生物分子的方法包括提供接头分子(11)，其包含含有反应中心的第一官能团(LG)、包含反应中心的第二官能团(FG)和可切割部分(例如可水解部分)(A‑B‑C)。所述方法还包括在所述生物分子(10)和第一官能团(LG)的反应中心之间形成共价键，在第一标记物(L1)和第二官能团(FG)的反应中心之间形成共价键，切割接头分子(11)的可切割部分(A‑B‑C)，例如水解接头分子(11)的可水解部分以去除第一标记物(L1)并且以形成包含反应中心的第三官能团(W)，并在其他分子和所述第三官能团(W)的反应中心之间形成共价键以重新形成可切割部分，例如可水解部分(A‑B‑C)。

本发明一般性地涉及生物分子的标记。更具体地，尽管并非排他性的，本发明涉及可逆地标记生物分子的方法。

生物缀合是其中在生物分子和第二分子之间形成共价键的化学策略。第二分子可以充当标签或标记物，在这种情况下，第二分子将赋予生物分子以新的特性。第二分子可赋予适合用于测量生物分子的位置和/或浓度的特性，例如，以跟踪细胞事件、确定酶功能、测量药物递送等。第二分子可以是例如荧光分子、放射性物质和/或适合用于检测测定的不同生物分子。或者，可以选择第二分子，以便其使生物分子在特定环境中更易溶解或更稳定。在其他情况下，第二分子可用于靶向另一个生物分子。

一些简单的缀合化学反应支配那些施加于生物分子的位点选择性化学修饰(或官能化)(例如，Hermanson,G.T.Bioconjugate Techniques,2013；BioconjugatedOligonucleotides:Recent Developments and Therapeutic Applications.Bioconjug.Chem.2019；Contemporary Approaches to Site-Selective ProteinModification.Nat.Rev.Chem.2019)。这些化学反应为后续分析通常依赖的多种操作、分类和标记实验奠定了基础。

然而，这些方法的重点始终是在靶标生物分子和必需的功能部分之间建立稳定的联系。因此，官能化可以将生物分子的研究限制在单一的分析过程中。这种方法与最近的细胞生物学研究(其中观察细胞行为的综合方法变得越来越重要)不一致。

最近为解决一个或更多个这些问题做出的努力包括以下现有技术。Bernades等已经报道了双功能接头的开发，该接头同时允许位点特异性蛋白质修饰和钯介导的生物正交decaging。这是通过炔丙基氨基甲酸酯接头中的硫醚结合基序和易于获得的钯复合体实现的(Bernades et al.Chem.Sci.,2018,9,4185,Angew.Chem.Int.Ed.Vol 57,36,2018；Chem.Sci.,2016,7,4589-4593)。

据报道，在蛋白质的捕获和释放中使用可切割的重氮键作为监测内源性甲基转移酶活性的工具(Lou et.al.,J.Am.Chem.Soc.2012,134,36,14905-14912)。在标记和捕获之后，可以通过用连二亚硫酸钠切割重氮基团释放蛋白质。

已经报道了可逆的mTAG标记策略，其中使用紫外线去除标记部分(参见Chem.Commun.,2018,54,449-451)。光触发的去除是绝对的，其意味着DNA分子的重复标记是必要的。另外，标记部分不包含用于进一步官能化的官能性。

因此，本发明的第一个非排他性目的是提供将生物分子可逆地与第二分子例如标记物连接的生物正交方法。本发明的其他非排他性目的之一是提供在无限循环中标记、去标记和重新标记生物分子的生物正交方法，以便可以对单个样品顺序地进行多次分析。本发明的其他非排他性目的是提供回收第二或其他分子的生物正交方法。

因此，本发明的第一方面提供了可逆地标记生物分子的方法，该方法包括：

a.提供接头分子，接头分子包含含有反应中心的第一官能团、含有反应中心的第二官能团和可切割部分例如可水解部分；

b.在生物分子和第一官能团的反应中心之间形成共价键；