[发明专利]用于测序的DNA和RNA的单管制备

说明书

本发明是用于同时地从存在于样品中的DNA和RNA形成用于核酸测序的文库的方法和组合物。

技术领域

本发明涉及核酸测序领域。更具体地，本发明涉及富集用于测序的罕见核酸靶标的领域。

背景技术

对于DNA样品和RNA样品的单独制备和测序，存在许多工作流程。当需要从DNA和RNA两者获取信息时，一些工作流程是完全独立的，而其他工作流程可能会在过程中的某个步骤作为一个工作流程加入。在任一种情况下，如果需要从来自单一来源(例如患者样品)的DNA和RNA两者获取信息，则需要两个单独的样本，一个用于分离DNA，另一个用于分离RNA。这导致样品材料以及劳动力和试剂成本的浪费。对于珍贵的样品，诸如临床活检样品、法医样品或历史样品，可能没有足够的材料来对DNA和RNA执行两次单独的分离。出于对RNA相关步骤可能会损害DNA(例如通过变性)，而DNA相关步骤可能会损害RNA的担心，组合的DNA和RNA工作流程被认为是不明智的。需要一种稳健的组合型RNA/DNA工作流程，其将会可靠地从同一试管中的样品中回收DNA和RNA。

发明内容

本发明是一种形成适用于核酸测序或其他下游分析的DNA文库的方法，其中文库中的靶标序列来源于细胞RNA和细胞DNA。尽管DNA和RNA靶标在单个工作流程中同时处理，但在完成该方法后，它们仍可区分为分别源自DNA或RNA。

在一些实施例中，本发明是制备用于测序的RNA和DNA靶标混合物的方法，该方法包括：提供包含RNA和DNA靶标的样品；在不允许DNA变性的条件下使所述样品与靶标特异性引物接触；用具有反转录酶活性的核酸聚合酶延伸与至少一个RNA靶标杂交的靶标特异性引物以形成cDNA链；以及使所述样品与RNaseH活性及核酸末端修复活性接触以形成双链DNA和双链cDNA混合物。靶标特异性引物可以包括条形码，该条形码将双链DNA和双链cDNA混合物中的cDNA分子与DNA分子区分开。核酸末端修复活性可由DNA聚合酶、核酸外切酶和多核苷酸激酶的混合物组成。在一些实施例中，该方法进一步包括对RNA和DNA靶标进行片段化的预备步骤。在一些实施例中，该方法进一步包括使双链DNA和双链cDNA混合物与具有一个或多个条形码的衔接子接触，该一个或多个条形码例如唯一分子标识符(UID)和样品标识符(SID)。在一些实施例中，该方法进一步包括在测序前对衔接的DNA进行扩增之后任选地对衔接的DNA进行测序的步骤。

在一些实施例中，本发明是一种核酸文库，该核酸文库由包含以下各项的方法形成：提供包含RNA和DNA靶标的样品；在不允许DNA变性的条件下使所述样品与靶标特异性引物接触；用具有反转录酶活性的核酸聚合酶延伸与至少一个RNA靶标杂交的靶标特异性引物以形成cDNA链；以及使所述样品与RNaseH活性及核酸末端修复活性接触以形成双链DNA和双链cDNA混合物。双链DNA和双链cDNA混合物可以进一步包括衔接子。靶标特异性引物可以包括条形码，使得双链cDNA可通过条形码的存在与双链DNA区分。

在一些实施例中，本发明是一种用于通过本文描述的新颖的方法制备用于测序的RNA和DNA靶标混合物的试剂盒，该试剂盒包括：一个或多个靶标特异性引物，其具有条形码；核酸聚合酶，其具有反转录酶活性；RNaseH；DNA聚合酶，其具有3′-5-核酸外切酶活性；多核苷酸激酶并且任选地，衔接子和DNA连接酶，其中该衔接子包括一个或多个分子条形码和通用引物结合位点。

附图说明

图1是工作流程初始部分的示意图。

图2是部分工作流程的示意图。

图3是工作流最后部分的示意图。

图4示出了应用于细胞系样品的组合的DNA/RNA协议的实验验证。

具体实施方式

定义