[发明专利]一种重组谷氨酸棒杆菌及谷胱甘肽的制备方法

说明书

本发明涉及一种重组谷氨酸棒杆菌及谷胱甘肽的制备方法，所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌中过表达双功能谷胱甘肽合成酶的基因。采用本发明的谷氨酸棒杆菌基因工程菌作为出发菌株，通过发酵法生产谷胱甘肽，不仅谷胱甘肽产量高、得率高，而且操作简单、方便，同时食品级的谷氨酸棒杆菌安全无毒，符合节约资源、环境友好的生产理念，本发明为重组谷氨酸棒杆菌工业化生产谷胱甘肽提供了参考和借鉴。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种利用重组谷氨酸棒杆菌制备谷胱甘肽的方法。

背景技术

谷胱甘肽(γ-L-glutamyl-cysteinyl-glycine，GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三种氨基酸缩合而成的一种活性三肽类化合物，广泛存在于各种生物体内。还原型的谷胱甘肽在活组织中具有许多重要的功能，谷胱甘肽可以提高人体免疫力、抗衰老，在老人迟缓化的细胞上所发挥的功效比年轻人大，谷胱甘肽对于治疗放射线、放射性药物所引起的白细胞减少等症状也都具有非常显著的效果。

目前谷胱甘肽的制备方法很多，常见的包括溶剂萃取法、化学合成法、生物发酵法和酶法。目前国内外生产谷胱甘肽主要是是采用发酵法或酶法，发酵法主要是将编码合成谷胱甘肽酶系或者双功能酶的基因克隆到大肠杆菌或酵母中，发酵培养获得谷胱甘肽，发酵法中酵母发酵法工艺较成熟。专利CN201810844388和CN201680013630分别在酵母和大肠杆菌中外源表达谷胱甘肽合成双功能酶基因，达到发酵生产谷胱甘肽的目的，但是产量很低。大肠杆菌也是一种条件致病菌，产生的重组蛋白、有机酸等产物中残留有大肠杆菌的相关抗原从而引起免疫反应；大肠杆菌也是良好的噬菌体的宿主菌，极易遭受噬菌体的感染。因此目前的发酵法并不适于生产食品级谷胱甘肽，且不符合节约资源、环境友好的生产理念。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组谷氨酸棒杆菌基因工程菌，利用其生产谷胱甘肽，具有产量高、得率高、安全无毒等优点。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明第一方面提供一种谷氨酸棒杆菌基因工程菌，所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌中过表达双功能谷胱甘肽合成酶的基因。

优选地，所述的双功能谷胱甘肽合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明中，所述的双功能谷胱甘肽合成酶基因来源于Streptococcusthermophilus(gshFst)。

本发明第二方面提供一种所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：

(1)将所述的双功能谷胱甘肽合成酶的基因克隆到pEC-XK99E质粒上，得到重组质粒；

(2)将所述的重组质粒转化谷氨酸棒杆菌，得到所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌。

在本发明中，所述的双功能谷胱甘肽合成酶基因可通过常规基因工程手段获得。例如可以Streptococcus thermophilus DNA为模板通过PCR扩增分离得到，也可根据其序列通过人工合成得到。

优选地，所述的步骤(1)的具体方法为：以质粒pET28a-gshFst为模板进行DNA的扩增，然后将扩增产物或质粒采用BamHI和PstI进行双酶切，再与经BamHI和PstI酶切处理后的所述的pEC-XK99E质粒进行连接，得到所述的重组质粒。

在本发明中，所述的重组质粒通过电转的方法转入到谷氨酸棒杆菌中。

本发明第三方面提供一种所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌在生产谷胱甘肽中的应用。

本发明第四方面提供一种谷胱甘肽的制备方法，采用所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌生产所述的谷胱甘肽。

优选地，采用补料分批发酵法生产所述的谷胱甘肽。