[发明专利]一种通用的细菌疫苗的制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种通用的细菌疫苗的制备方法和应用，本发明的制备方法是利用超高压强驱动细菌通过裂缝后形成稳定的细菌生物膜囊泡(BBV)，通过该方法，可驱动包括多种革兰氏阴性及革兰氏阳性耐药细菌，以及非耐药细菌产生BBV。BBV是人为驱动细菌制造产生，释放了细菌的胞内蛋白及核酸，相比细菌天然分泌的胞外囊泡(EV)，具有更高的产量及安全性；BBV可被DC细胞高效摄取并刺激其成熟，作为疫苗在体内具有诱导细菌特异性的体液及细胞免疫应答的双重功能。经测试显示，不同细菌来源的BBV疫苗都展示出抵抗各自细菌感染的特点以及良好的生物相容性。这种BBV通用疫苗制备平台的建立突破了EV疫苗的局限性，对细菌疫苗的发展具有重要意义。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种通用的细菌疫苗的制备方法和应用。

背景技术

全球耐药菌的感染越来越严重，已成为威胁人类生命健康的极大问题，据报道全世界每年有70万人死于耐药菌感染，如果不加以控制预计到2050年耐药细菌感染致死的人数将达到1000万并超过肿瘤死亡人数。在COVID-19期间，约有50％的死亡病人有继发性细菌感染，主要的感染细菌是肺炎克雷伯菌及鲍曼不动杆菌。耐药细菌由于其对抗生素抵抗，因此一旦感染难以控制，造成高致死率。目前最严重的耐药细菌是碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌，大肠杆菌，鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌，甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌，万古霉素耐药的粪肠球菌，这些细菌被称为“ESKAPE”，严重威胁人类生命健康。

但不幸的是新的抗生素研发周期非常缓慢，已无法赶上耐药细菌的发展速度。细菌的抗生素耐药问题日益严重，已严重威胁人类健康。绕开细菌耐药机制，发展新型耐药菌疫苗具有重要意义。

疫苗是抵抗耐药细菌感染的有效手段，疫苗的使用可以大大降低抗生素的使用量，也将减少细菌耐药性的发展速度。目前耐药细菌疫苗的制备方案主要是灭活疫苗、外膜蛋白疫苗、外膜囊泡疫苗、纳米疫苗、亚单位疫苗。其中胞外囊泡(EV)或叫外膜囊泡(OMV)由于其富含完整的抗原，没有感染性，便于基因工程改造及纳米结构的特点，是目前认为非常适合作为细菌性疫苗的理想组分。

但EV/OMV的一些不利因素严重限制了其进一步发展，主要是：(1)EV在革兰氏阴性菌中的产量很低，EV在革兰氏阳性菌中更少。(2)有效的疫苗成分是表面蛋白，而EV/OMV包含了除表面蛋白外的大量胞内蛋白。(3)EV/OMV包含了细菌的大量核酸，具有传递耐药基因的风险。(4)EV/OMV来源于细菌天然分泌，其质量控制难度较大。(5)EV/OMV制备的工艺在大规模放大时难度较大。综合EV/OMV的优点及缺点，若能改进疫苗制备技术突破EV疫苗的这些限制，将有利于耐药细菌疫苗的发展。

如何提高囊泡产量，提高安全性，增加保护性抗原覆盖度，增强特异性体液免疫及细胞免疫是改善疫苗设计的关键问题。

目前，生物膜的自组装技术已在真核生物中被广泛的应用，这包括在红细胞膜，免疫细胞膜，肿瘤细胞膜等，但基于原核生物膜的生物膜组装目前仍依靠细菌自分泌的EV/OMV而不是人为组装囊泡，这是由于细菌细胞膜具有大量孔蛋白、糖蛋白及肽聚糖等的特殊结构，给人为驱动形成生物膜组装囊泡的技术带来了困难，特别是具有厚的细胞壁的革兰氏阳性菌而言，其生物膜组装难度更大。

如何能够人为驱动细菌细胞膜形成生物膜组装囊泡，形成新型耐药菌疫苗，是一个需要解决的问题。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种通用的细菌疫苗的制备方法和应用，以细菌生物膜囊泡(BBV)代替EV/OMV，从而提高细菌疫苗的抗原性和安全性。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种通用的细菌疫苗的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在培养基中培养细菌，当OD600达到1.0时，将培养基离心，去除上清，细菌沉淀经洗涤后重悬，得到细菌悬浮液；