[发明专利]用于Sanger法的测序反应产物的变性方法

说明书

本发明提供一种用于Sanger法的测序反应产物的变性方法，所述方法包括：向96孔板中的用于Sanger测序技术的测序反应产物中加入去离子水或去离子甲酰胺，然后将96孔板置于振荡器上充分震荡，振荡后直接上机测序。本发明根据试剂HiDi的特性，利用实验室现有的仪器改为震荡后直接上机测序，减少了操作环节和高温导致的有害气体的产生，节省了操作时间以及不必要的人力物力的浪费。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种用于Sanger法的测序反应产物的变性方法。

背景技术

测序技术是分子生物学最重要的检测手段，是基因多态性和基因突变检测的金标准，也是其他众多技术方法的参考标准。测序技术的优势在于，直接测定样本的基因序列，得到基因变异的精确情况，并且能够对某一段DNA序列进行多位点突变检测，或未知突变检测，广泛应用在肿瘤靶向药物个体化治疗检测、遗传疾病基因突变检测、血液病基因突变检测、HLA分型与配型、病原微生物耐药性检测等诸多领域。

第一代DNA测序技术是1975年由Sanger和Coulson开创的链终止法，或Maxam和Gilbert发明的化学法(链降解)。其中常用的Sanger测序(双脱氧末端终止法)的原理是将被荧光标记的ddNTP掺入到dNTP中，由于ddNTP随机掺入，PCR产物从引物之后的第一个碱基开始，每一个位置都有可能是ddNTP。由于ddNTP缺乏链延伸所需要的3'-OH，链的延伸就选择性地在G、A、T或C处终止。这种PCR产物与普通PCR产物不同，不能形成一条电泳带，而是一组长度相差一个碱基的成百上千种片段。它们具有共同的起始点，终止在不同的核苷酸上，每一个碱基都有相同的概率被终止。将不同大小的片段进行毛细管电泳，通过对荧光信号的采集和拼接，最终获得目的片段的序列。其特点是高读长；检测通量中等；检测灵敏度低；单孔成本低，适用于少数基因的少量位点测序，广泛应用于临床检测和科学研究。DNA变性指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变，上机测序需要保持片段是单链，否则将严重影响测序质量。

目前常用方法是将测序反应产物在95℃变性3min，然后冷却；需要使用PCR仪或者水浴锅和冰块，可能产生一些有害气体，需要耗费较多的时间成本及人力成本等。因此，亟需对现有测序反应产物的变性方法进行改良。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于Sanger法的测序反应产物的变性方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种用于Sanger法的测序反应产物的变性方法，所述方法包括：向96孔板中的用于Sanger测序技术的测序反应产物中加入去离子水或去离子甲酰胺(HiDi)，然后将96孔板置于振荡器上充分震荡，振荡后直接上机测序。

前述的方法，按照DNA与去离子水或去离子甲酰胺16-300ng:10-30μL的比例，向96孔板的各孔中加入去离子水或去离子甲酰胺。

可以根据峰图的高低调整去离子水或去离子甲酰胺加入的量，10-30ulHiDi。一般地，扩增目的片段时人的DNA 16-100ng加入10μL HiDi。酶解纯化的PCR产物3μL(测序反应时取0.8μL的酶解产物测序)，只需加入10μL HiDi，峰高(信号值)即可维持在1000左右，峰高≥500RFU为合格，低于100RFU无法辨认序列中的碱基。

前述的方法，各孔中的DNA为经过纯化处理后自然晾干的DNA。

前述的方法，振荡器的设置如下：转速为780rpm左右，振幅为3mm左右，振荡时间为5min左右。

前述的方法，测序反应产物的大小为20-600bp(信号比较清晰，信号值平均在500RFU以上)。

优选地，所述DNA来自于人类。