[发明专利]一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性RT-PCR试剂盒及其使用方法

说明书

一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性RT‑PCR试剂盒及其使用方法，属于生物技术领域。该试剂盒包括A液(RT‑PCR缓冲液、RT‑DNA聚合酶和灭菌双蒸水)、B液(引物对、探针)、阴性质控标准品和阳性质控标准品组成，其中包括用于检测布鲁氏菌的特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2以及探针seq ID No.3，以及检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性的特异性引物对seq ID No.4和seq ID No.5以及探针seq ID No.6。该RT‑PCR试剂盒实用性强，耗时短，可重复性好，通过RT‑PCR扩增后，能够快速、有效、直观的鉴别临床样品中是否含有阿米卡星耐药性的布鲁氏菌。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性RT-PCR试剂盒及其使用方法

背景技术

布鲁氏菌(Brucella)是一种兼性胞内寄生菌，属于“B类生物恐怖主义药剂”，通过寄生于宿主的免疫系统造成宿主持续性感染，并且能引起全球性人畜共患病—布鲁氏菌病(以下简称布病)。布病影响公共卫生安全，其主要表现为发热、多汗、乏力、关节疼痛等，严重者使患者丧失劳动能力，最终影响经济发展[1]。《中华人民共和国传染病防治法》将布鲁氏菌病与“非典”、炭疽、艾滋病、狂犬病等均归为乙类传染病。常见引起人间布病感染的布鲁氏菌主要是羊种(B.melitensis)、牛种(B.abortus)、猪种(B.suis)和犬种(B.canis)。据统计，全球人间布鲁氏菌病发病率年平均超过50万例，一些流行国家每百万人口的布鲁氏菌发病率超过100[2]，中东地区每百万人口的布鲁氏菌病发病率均在200以上，叙利亚发病率最高(1603.4)，但据世界卫生组织(WHO)调查表明，实际发病率是报告的10-25倍[3]。我国布鲁氏菌病首次报道于内蒙古[4]，人间布鲁氏菌病疫情于1957-1963年和1969-1971年出现两次流行高峰。自20世纪90年代中期开始，布鲁氏菌病疫情在国内再次肆虐，并从北方扩展到南方[5]，全国32省市自治区均有病例报道[6]。现有的研究表明，我国布鲁氏菌病主要分布于内蒙古、新疆等畜牧业发达的省市及自治区，农牧民、兽医、屠宰工等感染和发病率较高。

布鲁氏菌药物敏感性检测需要在生物安全三级实验室内进行，长期以来，我国在布鲁氏菌耐药性检测方面所做工作不多。目前的研究表明，世界范围内出现了部分利福平耐药布鲁氏菌菌株[7]。阿米卡星作为部分地区治疗布病的药物，如果患者感染的布鲁氏菌菌株存在阿米卡星抗性，则严重影响患者的布病治疗。本方法利用布鲁氏菌分离株阿米卡星耐药表型和基因型的相关性，分析其基因组水平的阿米卡星耐药机制，结合RT-PCR方法，通过筛选确实可行的耐药基因检测序列，用于布鲁氏菌阿米卡星抗性的检测。本发明涉及仪器常见，成本较低，无需经过测序，通过目测荧光扩增曲线即可确定菌株的阿米卡星抗性，方法可应用于临床鉴别，切实为我国布鲁氏菌药物敏感性水平提供技术保障。

参考文献

1.Nelson-Jones A.Brucellosis[J].Postgrad Med J,1952.28(324):529-34.https://doi.org/10.1136/pgmj.28.324.529

2.Bukhari E E.Pediatric brucellosis.An update review for the newmillennium[J].Saudi Med J,2018.39(4):336-341.https://doi.org/10.15537/smj.2018.4.21896

3.Hasanjani Roushan M R and Ebrahimpour S.Human brucellosis:Anoverview[J].Caspian J Intern Med,2015.6(1):46-7.