[发明专利]一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法

说明书

本发明公开了一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法，1)Tn5转座打断和产物纯化，2)PCR文库富集，3)扩增产物片段大小分选，4)文库选择测序，本发明有利于文库扩增，得到高产量的文库，避免样本导致转座酶加入时间不同，引起打断片段大小有差异，精确度高，准确信强，并且提高了文库的保存时间。

技术领域

本发明涉及生物信息技术领域，尤其涉及一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法。

背景技术

病原微生物是指可以侵犯人体，引起感染甚至传染病的微生物，或称病原体。病原体中，以细菌和病毒的危害性最大。病原微生物指朊毒体、寄生虫(原虫、蠕虫、医学昆虫)、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒。病原微生物感染人体后极有可能产生病症，导致感染者出现对应的感染症状。当出现感染症状时，现有技术有多种方法进行检测以判断是哪种病原微生物，进而便于疾病的治疗。

mNGS作为一种不需培养的新型技术，可以深入快速鉴定感染病原体，相比传统培养方法拥有更高敏感性的同时又与“精准诊疗”的理念相契合。Gyarmati等在2016年发表的一篇文献中指出，mNGS可以直接从血液样本中鉴定不能培养的、苛养的以及非细菌(病毒和真菌)病原体。除此之外，mNGS可以用于传染病预防，具有直接从临床样本中获的病原体传播线索的潜力。2014年，Hasman等指出mNGS可用于尿液样本中病原体以及耐药基因的检测，而且不仅耐药基因的检测结果与药敏实验一致，也与基于纯培养物的全基因组测序(WGS)的进化分析结果相匹配。

发明内容

本发明的提供一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法。

本发明的方案是：

一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法，包括下列步骤：

1)Tn5转座打断和产物纯化，在第一无菌PCR管配制反应体系，使用移液枪上下吸打，充分混匀，然后将所述第一无菌PCR管放入PCR仪上，设定反应程序，进行反应，反应结束后，取出所述第一无菌PCR管，往其加入6X Termination Buffer，通过涡旋或移液枪上下吸打混匀手段，充分混匀后室温下孵育3～8min,往所述第一无菌PCR管内添加DNA纯化磁珠，使用移液枪上下吸打10次，充分混匀，室温静止8～12min，将所述第一无菌PCR管置于磁力架上4～6min，待所述第一无菌PCR管内溶液澄清后，移除上清，然后进行两次漂洗处理，通过移液枪移除位于所述磁力架上的所述第一无菌PCR管管底残留乙醇，打开所述第一无菌PCR管的管盖4～6min，然后取出所述第一无菌PCR管，往里加入灭菌超纯水，充分吸打混匀，室温孵育1～3min,然后重新将所述第一无菌PCR放入所述磁力加上，待所述第一无菌PCR管内溶液澄清后，吸取所述第一无菌PCR管内上清液，用于PCR反应样本；

2)PCR文库富集，将步骤1)中PCR反应样本加入到第二无菌PCR管中，随后在所述第二无菌PCR管中配制反应体系，混匀后含有PCR反应体系的第二无菌PCR管进行离心，放入PCR仪中，设定PCR的反应程序进行反应，得到扩增好的第二无菌PCR管；

3)扩增产物片段大小分选，吸取第一轮DNA磁珠加入到扩增好的第二无菌PCR管中，充分混匀，室温孵育4～6min,将所述第二无菌PCR管置于磁力加上，待溶液澄清后，将第二无菌PCR管中的上清转移至第三无菌PCR管中，丢弃磁珠，吸取第二轮DNA磁珠加入所述第三无菌PCR管中，充分混匀，室温精致4～6min，然后将所述第三无菌PCR管放在磁力架上，待溶液澄清后，移除上清，两次漂洗处理，保持所述第三无菌PCR管在磁力架上，用移液枪移除管底残留的乙醇，并打开管盖空气干燥至管中不再有残留乙醇，取出干燥好的所述第三无菌PCR管，加入灭菌超纯水，充分混匀，室温孵育2min，重新将所述第三无菌PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清液转移至新的无菌PCR管中，得到可测序文库；