[发明专利]一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法

权利要求书

1.一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)Tn5转座打断和产物纯化，在第一无菌PCR管配制反应体系，使用移液枪上下吸打，充分混匀，然后将所述第一无菌PCR管放入PCR仪上，设定反应程序，进行反应，反应结束后，取出所述第一无菌PCR管，往其加入6X Termination Buffer，通过涡旋或移液枪上下吸打混匀手段，充分混匀后室温下孵育3～8min,往所述第一无菌PCR管内添加DNA纯化磁珠，使用移液枪上下吸打10次，充分混匀，室温静止8～12min，将所述第一无菌PCR管置于磁力架上4～6min，待所述第一无菌PCR管内溶液澄清后，移除上清，然后进行两次漂洗处理，通过移液枪移除位于所述磁力架上的所述第一无菌PCR管管底残留乙醇，打开所述第一无菌PCR管的管盖4～6min，然后取出所述第一无菌PCR管，往里加入灭菌超纯水，充分吸打混匀，室温孵育1～3min,然后重新将所述第一无菌PCR放入所述磁力加上，待所述第一无菌PCR管内溶液澄清后，吸取所述第一无菌PCR管内上清液，用于PCR反应样本；

2)PCR文库富集，将步骤1)中PCR反应样本加入到第二无菌PCR管中，随后在所述第二无菌PCR管中配制反应体系，混匀后含有PCR反应体系的第二无菌PCR管进行离心，放入PCR仪中，设定PCR的反应程序进行反应，得到扩增好的第二无菌PCR管；

3)扩增产物片段大小分选，吸取第一轮DNA磁珠加入到扩增好的第二无菌PCR管中，充分混匀，室温孵育4～6min,将所述第二无菌PCR管置于磁力加上，待溶液澄清后，将第二无菌PCR管中的上清转移至第三无菌PCR管中，丢弃磁珠，吸取第二轮DNA磁珠加入所述第三无菌PCR管中，充分混匀，室温精致4～6min，然后将所述第三无菌PCR管放在磁力架上，待溶液澄清后，移除上清，两次漂洗处理，保持所述第三无菌PCR管在磁力架上，用移液枪移除管底残留的乙醇，并打开管盖空气干燥至管中不再有残留乙醇，取出干燥好的所述第三无菌PCR管，加入灭菌超纯水，充分混匀，室温孵育2min，重新将所述第三无菌PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清液转移至新的无菌PCR管中，得到可测序文库；

4)文库选择测序，洗脱下来的文库放在-20℃冰箱长期保存，后续用Agilent 2100Bioanalyzer软件包评价文库质量，文库质控合格后，根据文库大小选择测序模式。

2.如权利要求1所述的一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法，其特征在于，所述步骤1)中第一无菌PCR管配制反应体系如下：

往第一无菌PCR管中加组分时先加入ddH2O，再加入其它组分，最后统一加入TagmentEnzyme A50。

3.如权利要求1所述的一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法，其特征在于，所述步骤1)中设定反应程序如下：

热盖(75℃) on；

55℃ 5min；

12℃ hold。

4.如权利要求1所述的一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法，其特征在于，所述步骤1)中漂洗处理为：所述第一无菌PCR管加入80％乙醇漂洗磁珠，孵育30s后移除上清液。

5.如权利要求1所述的一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法，其特征在于，所述步骤2)中第二无菌PCR管中配制反应体系如下：

6.如权利要求1所述的一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法，其特征在于，所述步骤2)中设定PCR的反应程序如下：

其中，步骤S4至S6进行7次循环。