[发明专利]一种同时检测DNA与RNA的寡核苷酸芯片及其使用方法

权利要求书

1.一种同时检测DNA与RNA的寡核苷酸芯片及其使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1对于选定基因及其转录形成的mRNA，分别设计相应的扩增引物，其中，RT-PCR扩增引物包括：RNA检测探针以及基于两个相邻外显子设计的游离引物，RNA检测探针是基于成熟mRNA的polyA及其相邻序列设计，能够与成熟mRNA的3'末端的polyA及其相邻序列互补配对；基于两个相邻外显子设计的游离引物能够与RNA检测探针配合完成RT-PCR扩增，从成熟mRNA中相邻两个外显子序列中选取，由于不包括两个外显子之间的内含子，基于两个相邻外显子设计的游离引物优先与cDNA第一条链结合，并受到内含子影响不结合基因组DNA；RNA检测探针通过连接臂固定在基片上；

PCR扩增引物包括：DNA检测探针及DNA检测探针匹配游离引物，均依据基因的内含子序列设计，DNA检测探针通过连接臂固定在基片上；

S2将RNA检测探针与DNA检测探针按规划固定在基片上，保证探针序列都通过连接臂与基片连接，连接臂仅增加探针的空间自由度并不参与识别与结合；

S3提取待测样品中的核酸，充分去除蛋白质，尤其是充分去除核酸酶，使用核酸酶抑制剂要注意不能干扰聚合酶活性；

S4在基因芯片上组装RT-PCR反应体系，其中反应底物中有一种标记dNTP，RT-PCR反应中聚合酶将标记dNTP整合到新合成的RNA检测探针延伸链中；同时，在基因芯片上组装PCR反应体系，PCR反应中聚合酶将标记dNTP整合到新合成的DNA检测探针延伸链中；

S5通过清洗去除RT-PCR反应组分、PCR反应组分及所有未与基片连接的核酸链，与新合成的RNA检测探针延伸链配对的非固定在基片上的核酸链通过变性后洗脱的方法去除，与新合成的DNA检测探针延伸链配对的非固定在基片上的核酸链也通过变性后洗脱的方法去除，在基因芯片上仅保留连接在基片上未反应的探针以及完成延伸反应的探针，标记dNTP通过整合在探针延伸链上而保存在基片上，且分别位于新合成的RNA检测探针延伸链和新合成的DNA检测探针延伸链中；

S6利用click反应完成对标记dNTP的最终可识别标记基团修饰（形成可检测的阳性信号），进行基因芯片的信号识别检测并形成检测结果。

2.根据权利要求1所述的一种同时检测DNA与RNA的寡核苷酸芯片及其使用方法，其特征在于，利用核酸聚合酶（包括依赖DNA的DNA聚合酶和反转录酶）提升基因芯片检测的准确性，在碱基互补配对杂交检测的基础上增加了依赖聚合酶对碱基互补配对准确性的再次校验。

3.根据权利要求1所述的一种同时检测DNA与RNA的寡核苷酸芯片及其使用方法，其特征在于，RT-PCR扩增区域对应于靶标基因的下游，PCR扩增区域对应于靶标基因的上游，减少互相干扰。

4.根据权利要求1所述的一种同时检测DNA与RNA的寡核苷酸芯片及其使用方法，其特征在于，RNA检测探针与成熟mRNA的3'末端序列互补，不仅包括oligo-dT，还包括对应于mRNA的3'末端序列中polyA相邻部分。

5.根据权利要求1所述的一种同时检测DNA与RNA的寡核苷酸芯片及其使用方法，其特征在于，基于两个相邻外显子设计的游离引物从成熟mRNA中相邻两个外显子序列中选取，利用两个外显子之间的内含子保证基于两个相邻外显子设计的游离引物优先与cDNA结合，且不受基因组DNA影响。

6.根据权利要求1所述的一种同时检测DNA与RNA的寡核苷酸芯片及其使用方法，其特征在于，DNA检测探针及DNA检测探针匹配游离引物均依据选定基因中的内含子序列设计，避免PCR反应与RT-PCR反应相互干扰。

7.根据权利要求1所述的一种同时检测DNA与RNA的寡核苷酸芯片及其使用方法，其特征在于，标记dNTP通过聚合酶整合到探针延伸链上用于形成检测信号，在检测时只保留固定在基片上的核酸链并去除非固定核酸链，能够有效提高信噪比。