[发明专利]基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及应用

说明书

本发明公开了基于RT‑RPA和CRISPR/Cas的DHAV‑1和DHAV‑3检测体系及应用，基于RT‑RPA和CRISPR/Cas的DHAV‑1和DHAV‑3检测体系包括RT‑RPA体系和CRISPR/Cas体系，RT‑RPA体系包括DHAV‑1的RT‑RPA扩增引物RPA‑F1/RPA‑R1和DHAV‑3的RT‑RPA扩增引物RPA‑F3/RPA‑R3，CRISPR/Cas体系同时包括CRISPR//Cas12a和CRISPR//Cas13a两种蛋白，Cas12a为LbCas12a，Cas13a为LwCas13a。本发明基于RT‑RPA和CRISPR/Cas的DHAV‑1和DHAV‑3检测体系能够快速、精准检测DHAV‑1和DHAV‑3，而且可检测出含单拷贝DHAV‑1和DHAV‑3的样品，灵敏度高，而且可一次性全面检测DHAV‑1和DHAV‑3，并且区分是血清1型或是血清3型感染或是共感染，检测体系可在恒温37℃进行反应，对设备要求低，将上述DHAV‑1和DHAV‑3检测体系制作为试剂盒适用于推广使用。

技术领域

本发明属于病原检测技术领域，具体涉及基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及应用。

背景技术

鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)引起的鸭病毒性肝炎主要侵害1～3周龄的雏鸭。感染该病毒后发病过程迅速，雏鸭在感染24小时左右即发病，并且该病毒的传染性强、致死率高，感染后雏鸭的病死率可高达90％以上，因此DHAV对我国养鸭业造成了严重影响。DHAV现有3个血清型，我国主要流行血清1型(DHAV-1)和血清3型(DHAV-3)。目前，DHAV-1疫苗已推广使用，并且也已有成功获得DHAV-3弱毒疫苗候选株的研究报道。因此，疫情的实时监测和及时的疫苗接种是有效防控鸭甲型肝炎的重要手段。

目前，针对鸭甲型肝炎病毒的检测方法有常规的如病毒中和试验、ELISA、电镜检测、胶体金试纸等，这些方法有其各自的优势，但也存在例如操作复杂、耗时较长、灵敏度和特异性差等缺点。另外，实时荧光定量PCR技术也是目前广泛应用于DHAV检测的技术，然而该方法对于Ct值接近临界点的样本常常无法准确判断检测结果，并且仪器设备价格昂贵，难以在基层普及应用。

这两年新兴的基因编辑工具CRISPR/Cas系统已被应用于核酸诊断检测，在2018年其被美国Science杂志誉为“下一代分子诊断技术”。CRISPR/Cas的核酸检测技术与现在检测最常用的qPCR和ELISA相比更快速且易实施。CRISPR/Cas检测可以与基于等温扩增技术的RPA技术结合，这样可以不需要复杂的仪器设备即可完成检测；另外，该技术的检测结果也可以用试纸条进行显色，因此CRISPR/Cas检测技术在疫病的现场快速检测方面也具有非常大的应用潜力。目前，还没有将CRISPR/Cas检测技术运用于DHAV检测的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及应用，采用该检测体系可同时检测DHAV-1和DHAV-3，特异性好，灵敏度高，并且可应用于开发现场快速检测试剂盒或检测产品。

为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：一种基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系，包括RT-RPA等温扩增体系和CRISPR/Cas检测体系，RT-RPA等温扩增体系包括DHAV-1的RT-RPA扩增引物和DHAV-3的RT-RPA扩增引物，DHAV-1的RT-RPA扩增引物为SEQ ID NO.3所示的RPA-F1和SEQ ID NO.4所示的RPA-R1，DHAV-3的RT-RPA扩增引物为SEQ ID NO.5所示的RPA-F3和SEQ ID NO.6所示的RPA-R3，CRISPR/Cas检测体系包括CRISPR//Cas12a和CRISPR//Cas13a，Cas12a为LbCas12a，Cas13a为LwCas13a。