[发明专利]基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及应用

权利要求书

1.一种基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测组合物，其特征在于，包括RT-RPA等温扩增体系和CRISPR/Cas检测体系，所述RT-RPA等温扩增体系包括DHAV-1的RT-RPA扩增引物和DHAV-3的RT-RPA扩增引物，所述DHAV-1的RT-RPA扩增引物为SEQ ID NO.3所示的RPA-F1和SEQ ID NO.4所示的RPA-R1，所述DHAV-3的RT-RPA扩增引物为SEQ ID NO.5所示的RPA-F3和SEQ ID NO.6所示的RPA-R3，所述CRISPR/Cas检测体系包括CRISPR//Cas12a和CRISPR//Cas13a，所述Cas12a为LbCas12a，所述Cas13a为LwCas13a。

2.根据权利要求1所述的基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测组合物，其特征在于：所述RT-RPA等温扩增体系还包括Rehydration Buffer、RNase Inhibitor、模板RNA、RNase free water和醋酸镁。

3.根据权利要求1所述的基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测组合物，其特征在于：所述Cas12a识别的靶向DHAV-1序列的crRNA为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的crRNA1：所述Cas13a识别的靶向DHAV-3序列的crRNA为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的crRNA3。

4.根据权利要求1所述的基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测组合物，其特征在于：所述CRISPR/Cas检测体系还包括检测探针、T7 RNA聚合酶、RNase Inhibitor、NTPs Mix、MgCl₂、RT-RPA反应产物和RNase free water。

5.根据权利要求4所述的基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测组合物，其特征在于：所述检测探针包括CRISPR//Cas12a可剪切的携带VIC荧光基团用于检测DHAV-1的ssDNA探针和CRISPR//Cas13a可剪切的携带FAM荧光基团用于检测DHAV-3的ssRNA探针，所述携带VIC荧光基团的ssDNA探针的序列为5’-VIC-TTATTATT-BHQ1-3’，所述携带FAM荧光基团的ssRNA探针的序列为5’-FAM-UUUUUUUC-BHQ1-3’。

6.根据权利要求5所述的基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测组合物，其特征在于：所述检测探针为在权利要求5所述的用于检测DHAV-1的ssDNA探针和用于检测DHAV-3的ssRNA探针基础上改变报告基团后获得的探针。

7.根据权利要求6所述的基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测组合物，其特征在于：所述检测探针为在权利要求5所述的用于检测DHAV-1的ssDNA探针和用于检测DHAV-3的ssRNA探针基础上将荧光报告基团去除后在探针的巯基处修饰纳米金或在探针的3’端引入Biotin基团后获得的探针。

8.一种采用权利要求1-7任一项所述基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测组合物的DHAV-1和DHAV-3检测试剂盒。

9.权利要求1-7任一项所述的基于RT-RPA和CRISPR/Cas检测组合物或权利要求8所述的DHAV-1和DHAV-3检测试剂盒在制备DHAV-1和DHAV-3检测产品中的应用。