[发明专利]一种GLP-1类似物的半重组制备方法

说明书

本发明公开了一种GLP‑1类似物的半重组制备方法。本发明通过将具有融合基因和顺式助溶蛋白因子DsbA的大肠杆菌重组工程菌株进行发酵，经诱导表达得到融合蛋白，提取并纯化融合蛋白，在特定的体外条件下定点化学修饰获得经脂肪酸侧链修饰的融合蛋白分子，最后经特异性酶切获得利拉鲁肽和索马鲁肽分子。所述的融合基因具有以下结构通式：f‑l‑a；其中，f为伴侣蛋白的编码基因，l为连接肽的编码基因，a为GLP‑1类似物的编码基因。本发明结合了重组表达和化学合成的技术优势，具有发酵产量高、可溶性表达蛋白比例高、修饰正确率高、纯化制备简单等特点，适用于工业化放大生产利拉鲁肽和索马鲁肽。

技术领域

本发明涉及DNA重组及化学法制备融合蛋白技术领域，具体涉及一种GLP-1类似物的半重组制备方法。

背景技术

人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是37个氨基酸残基的胃肠激素，参与血液葡萄糖代谢、胃肠分泌和代谢及食物摄取的调节。GLP-1以葡萄糖依赖性方式刺激胰岛素分泌，刺激胰岛素生物合成，促进β细胞拯救，减少胰高血糖素分泌、胃排空和食物摄取，从而达到稳定的降糖效果，不易诱发低血糖。

由于GLP-1及其类似物在治疗2型糖尿病的优良效果，使其近年来在糖尿病治疗药物市场中逐渐占据重要地位。人体内具有生物活性的GLP-1主要是GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)，天然的GLP-1容易被血浆酶二肽基肽酶IV(DPP-IV)迅速水解失活，不具有临床使用价值。因此，对GLP-1结构进行修饰，形成具有同样药理活性的GLP-1类似物，并掩盖DPP-IV的结合位点，延长半衰期是该类药物研发的主要课题。现今已有多个GLP-1类似物上市，如：利拉鲁肽、艾塞那肽、阿必鲁肽、杜拉鲁肽等，该类药物在未来10年内将会是抗糖尿病药物的重要增长点。

利拉鲁肽(Liraglutide)是一种每日皮下注射一次的酰胺化长效GLP-1类似物。利拉鲁肽是将GLP-1(7-37)的Lys34替换成Arg，并且在Lys26连接一条16碳棕榈脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))而得到的衍生物，与天然GLP-1有97％的同源性。注射利拉鲁肽后，其侧链上连接的16碳棕榈脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))链可驱动利拉鲁肽分子自联形成稳定的七聚体，从而延缓吸收；并且还可以在体内通过非共价键作用与人体血清白蛋白连接形成生物大分子物质，达到有效延缓肾脏的清除、DPP-IV的代谢作用以及促进该药从注射部位缓慢释放等作用，它的血浆半衰期长达约13h。

索马鲁肽(semaglutide)是一种每周注射一次的长效GLP-1类似物。索马鲁肽是将GLP-1(7-37)的Lys34替换成Arg，第Ala8位替换为α-氨基异丁酸，并且在Lys26连接一条18碳脂肪二酸侧链，而得到的衍生物，与天然GLP-1有94％的同源性。相比利拉鲁肽，索马鲁肽增长的碳链对白蛋白的亲和力增强5-6倍，与白蛋白结合，增大了分子量，避免快速被肾脏清除，并防止代谢性降解，延长了体内半衰期，其半衰期可长达一周。

目前对于GLP-1类似物的生产制备工艺上，可以分为化学与生物两大途径。只含有蛋白氨基酸(即天然氨基酸)的多肽，例如天然GLP-1，可以采用重组技术或通过化学合成法产生。然而，还含有非蛋白氨基酸的多肽，例如N端突出端的GLP-1类似物，目前无法通过重组表达技术以实用的方式制备，而一般是通过化学合成法制备。

当采用化学法合成GLP-1类似物、GLP-1的截短类似物和GLP-1的衍生物时，例如中国专利CN102875665B一种合成利拉鲁肽的方法、CN103275208B利拉鲁肽的制备方法等，以上化学合成方法需要用到大量的有机溶剂，对环境造成严重污染，并且化学合成副反应较多，产率低，所使用的氨基酸原料成本高，整体生产成本较高。