[发明专利]一种GLP-1类似物的半重组制备方法

权利要求书

1.一种融合基因，其特征在于，所述的融合基因具有以下结构通式：f-l-a；其中，f为伴侣蛋白的编码基因，l为连接肽的编码基因，a为GLP-1类似物的编码基因；所述的伴侣蛋白为不含有赖氨酸的酸性蛋白；所述的连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示；所述的GLP-1类似物选自GLP-1(7-37)、GLP-1(9-37)或GLP-1(11-37)多肽类似物；

所述的伴侣蛋白为TrxA，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

2.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述的融合基因核苷酸序列为SEQ IDNO:1，其编码的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

3.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述的融合基因核苷酸序列为SEQ IDNO:2，其编码的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。

4.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述的融合基因核苷酸序列为SEQ IDNO:3，其编码的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:7。

5.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述的融合基因核苷酸序列为SEQ IDNO:4，其编码的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。

6.一种GLP-1类似物的半重组制备方法，其特征在于，所述的半重组制备方法包括如下步骤：

S1.构建权利要求1-5任一项所述的融合基因并连接到表达载体上，将顺式助溶蛋白因子DsbA表达单元连接到表达载体的下游，将表达载体转化至大肠杆菌中，经筛选得到重组工程菌株；

S2.将步骤S1所得重组工程菌株进行发酵，经诱导表达得到融合蛋白，提取并纯化融合蛋白溶液；

S3.将步骤S2所得融合蛋白溶液与DMF充分混合均匀，用二异丙基乙胺将融合蛋白溶液的pH调节至11-12，并加入一定量的脂肪酸链活化物进行修饰反应；

S4.待步骤S3反应完后加入赖氨酰内切酶进行酶切反应，反应结束后经HPLC纯化、冷冻干燥获得GLP-1类似物。

7.根据权利要求6所述的半重组制备方法，其特征在于，所述的脂肪酸链活化物为N-棕榈酰基谷氨酸-γ-N-羟基琥珀酰亚胺酯或17-{(S)-1-叔丁氧基羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基乙氧基)乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十七烷酸叔丁酯。

8.根据权利要求6所述的半重组制备方法，其特征在于，所述的脂肪酸链活化物的用量为：1mol融合蛋白加入1.7-2.2mol脂肪酸链活化物。

9.根据权利要求6所述的半重组制备方法，其特征在于，所述的赖氨酰内切酶的用量为：1g融合蛋白加入1-2AU赖氨酰内切酶。