[发明专利]一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法及应用

说明书

本发明公开了一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法及应用，包括以下步骤：1)菌体裂解；2)镍柱亲和纯化；3)酶切；4)镍柱穿透；5)C18‑100A柱纯化；6)C18‑300A反向色谱纯化；7)旋蒸与冻干。本发明提供的可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法及应用，采用镍亲和层析法从表达产物中分离Trx‑hPTH(1‑34)融合蛋白，再用酶切将重组特立帕肽从Trx‑hPTH(1‑34)融合蛋白中释放出来，通过三步层析方法制备纯化的重组特立帕肽，简化了纯化过程，提高了可溶性重组特立帕肽的纯化效率与纯度，对制备治疗骨质疏松症和骨折患者药物的原料药重组特立帕肽有重要帮助。

技术领域

本发明属于生物技术与制药工程技术领域，具体涉及一种重组特立帕肽的非变性纯化 方法及应用。

背景技术

人甲状旁腺素(Human Parathyroid Hormone,hPTH)是调节血液中钙磷代谢的主要激 素，由甲状旁腺主细胞分泌，是一种由84个氨基酸组成的多肽，它可与甲状旁腺素受体 结合，对骨代谢发挥双向作用。hPTH受体属于G蛋白偶联受体超家族，受体分为I型和 II型。hPTH-I受体主要分布于骨骼及肾，hPTH-II受体分布于脑和胰腺。甲状旁腺素的N 端肽链与hPTH-I受体结合发挥促进骨细胞生长的作用，而C端肽链与hPTH-II受体结合， 可发挥促进骨细胞凋亡的作用。

人甲状旁腺素1-34肽(hPTH1-34)，又称特立帕肽，是甲状旁腺素在人体内代射的天 然降解产物，由人内源性甲状旁腺素N端的1-34位氨基酸组成。与天然完整的由84个氨基酸组成的hPTH分子相比，特立帕肽保留了完整hPTH促成骨细胞生长的作用，去掉了 促进骨细胞凋亡作用。因此，特立帕肽及其类似物是开发能有效治疗骨质疏松、骨折药物 的潜在候选靶分子，具有广阔的临床应用前景。

由于特立帕肽是一个小分子短肽，不含二硫腱，采用基因工程原核重组表达法进行制 备具有生产规模大、生产成本低、生产周期短等明显优势，是特立帕肽制备最常用方法之 一。由于甲状旁腺素是一个真核细胞分子，在大肠杆菌中进行表达易形成包涵体，需要采 用变性条件先将含特立帕肽的包涵体进行变性溶解，然后在变性条件下通过层析方法进行 纯化和复性。目前，最常用的重组特立帕肽纯化方法多为变性条件的包涵体纯化方法。由 于变性条件包涵体纯化方法需要使用大量的变性剂，如尿素、盐酸胍等，不仅存在生产成 本高、生产周期长、易造成环境污染的缺点，而且生产出来的重组特立帕肽的产量低、纯 度差，不能满足大规模商业化生产的需要。因此，迫切需要开发以可溶性表达的重组特立 帕肽为主的工程菌及发酵、纯化工艺，以提高重组特立帕肽的生产效率。

为解决现有技术以包涵体形式表达重组特立帕肽的纯化困难问题，申请人构建了一种 将甲状旁腺素1-34肽与硫氧还蛋白进行融合表达的工程菌pET28b-Trx-hPTH(1-34)/E.coli BL21(DE3)，该菌株经过特定的发酵工艺发酵可获得高可溶性表达水平的硫氧还蛋白甲 状旁腺素1-34肽融合蛋白[Trx-hPTH(1-34)]的发酵产物，本发明在此基础上发明了一种 可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法，可以在非变性条件下将重组特立帕肽从Trx-hPTH (1-34)融合蛋白中完整地释放出来，并能有效去除重组表达的特立帕肽中的杂质，获得 的重组特立帕肽纯度可以达至99％以上，从而提高重组特立帕肽的生产效率，为商业化特 立帕肽原料药的生产创造了条件。

发明内容

为解决现有技术中以包涵体形式纯化重组特立帕肽的方法中存在的技术问题，本发明 的目的在于提供一种重组特立帕肽的非变性纯化方法及应用。

为实现上述目的，达到上述技术效果，本发明采用的技术方案为：

一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法，包括以下步骤：

1)菌体发酵、裂解、离心：将发酵的表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的发酵细菌菌体进行裂解，离心，收集裂解产物上清液；