[发明专利]一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法及应用

权利要求书

1.一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)菌体发酵、裂解、离心：将发酵的表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的发酵细菌菌体进行裂解，离心，收集裂解产物上清液；

2)镍柱亲和纯化：将步骤1)所得样品上镍亲和层析柱，洗脱结合在镍亲和层析柱上的Trx-hPTH(1-34)融合蛋白，得到亲和纯化的Trx-hPTH(1-34)融合蛋白；

3)酶切：使用肠激酶对步骤2)所得Trx-hPTH(1-34)融合蛋白进行切割，使得重组特立帕肽从融合蛋白中释放下来；Trx-hPTH(1-34)融合蛋白经过切割后产生两个肽段：Trx部分肽段和重组特立帕肽hPTH(1-34)；

4)镍柱穿透：将步骤3)所得酶切产物上一个新的镍亲和层析柱，带有6×His标签的Trx部分肽段结合在镍亲和层析柱上，重组特立帕肽穿过镍亲和层析柱，收集穿透峰，得到初步纯化的重组特立帕肽；

5)C18-100A柱纯化：将步骤4)所得重组特立帕肽样品上C18-100A柱，用乙腈进行梯度洗脱，获得90％以上纯度的重组特立帕肽hPTH(1-34)；

6)C18-300A反向色谱纯化：取步骤5)C18-100A柱纯化的重组特立帕肽蛋白样品上C18-300A反向色谱柱，用乙腈进行梯度洗脱，获得99％以上纯度的重组特立帕肽；

7)旋蒸与冻干：将步骤7)所得样品进行加温，负压旋蒸，去除残留乙腈，然后进行真空冷冻干燥。

2.根据权利要求1所述的一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法，其特征在于，步骤1)中菌体裂解的步骤为：将发酵细菌菌体与柱平衡缓冲液混合、重悬，随后在冰浴条件下剪切、超声裂解，离心后收集裂解产物上清液，过滤；所述柱平衡缓冲液的组分包括：25mMTris-HCl和1-10mM咪唑，柱平衡缓冲液的pH值为7-9。

3.根据权利要求1所述的一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法，其特征在于，步骤2)中镍柱亲和纯化的步骤为：将步骤1)所得样品上镍亲和层析柱，步骤1)所得样品与层析胶的体积比为1:1-2，上柱结束后先以柱平衡缓冲液洗柱，柱平衡缓冲液体积为镍亲和层析柱柱床体积的2-3倍，以去除未与层析胶结合的杂蛋白，再用洗脱缓冲液洗脱Trx-hPTH(1-34)融合蛋白，收集洗脱峰，得到亲和纯化的Trx-hPTH(1-34)融合蛋白，所述洗脱缓冲液的组分包括：50mM醋酸钠和0.5M NaCl，洗脱缓冲液的pH为2-6。

4.根据权利要求1所述的一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法，其特征在于，步骤3)中酶切步骤为：将步骤2)所得Trx-hPTH(1-34)融合蛋白溶液与10×酶切缓冲液按体积比10：1的比例进行混合，调节溶液的pH值至6-8，随后加入肠激酶，于4-37℃条件下孵育3-24h后进行酶切，每1IU肠激酶对应加入0.2-2mg Trx-hPTH(1-34)融合蛋白。

5.根据权利要求1所述的一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法，其特征在于，步骤4)中，镍亲和层析柱的镍亲和胶与步骤3)所得酶切产物的质量比为1000：20-60；通过洗柱液洗柱，用于冲洗非特异吸附的特立帕肽；所述洗柱液的组成包括：20mM Tris和10-40mM咪唑，pH 8.0。

6.根据权利要求1所述的一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法，其特征在于，步骤5)中C18-100A柱纯化的步骤为：用2M醋酸钠、乙腈和去离子水来调节步骤4)获得的初步纯化的重组特立帕肽溶液，使醋酸钠的终浓度达到50mM、乙腈浓度达至5％，调节溶液pH值为5.5-6.5；装C18-100A柱，层析胶与样品的质量比为100:0.5-1.0；以10％浓度的乙腈洗柱，再以含50mM NaAc和10％乙腈的平衡液平衡柱；将初步纯化的特立帕肽溶液上C18-100A柱，上样结束再以5个柱体积平衡液洗柱，然后用100％乙腈进行梯度洗脱，洗脱梯度15％逐步增加到35％，收集各洗脱峰，进行SDS-PAGE分析和有关物质含量分析。