[发明专利]一种利用水稻内源序列抑制HIS1基因表达的RNAi植物表达载体及其应用

说明书

本发明提供了一种利用水稻内源序列抑制HIS1基因表达的RNAi植物表达载体及其应用，以及一种干扰植物HIS1基因表达的方法和获得除草剂显性敏感植物的方法。将本发明的RNAi植物表达载体转化水稻，能够成功抑制水稻基因HIS1的表达，并将水稻从对除草剂具有抗性转变为敏感，使得敏感植株可以通过施用除草剂的方式被清除，从而培育了一种对除草剂显性敏感的水稻。该水稻在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种利用水稻内源序列抑制HPPD抑制剂敏感型1基因(HIS1)的植物表达载体和其构建方法和应用。

背景技术

转基因技术在各种农作物领域的应用越来越广泛，转基因产品需要加以严格的控制和监管，防止转基因漂移污染其他品种甚至其他物种就显得尤为重要。因此，需要建立一种能够定向清除杂交种子或转基因植株的机制。培育获得除草剂敏感的不育系或恢复系是解决问题的有效手段之一。

β-三酮类除草剂(b-Triketone herbicides,bTHs)是4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂，广泛应用于农业，可有效地防除多种阔叶杂草和禾本科杂草。用于稻田中杂草控制的bTH双环磺草酮(benzobicyclon,BBC)，对于可以对抗其他类型除草剂(包括磺酰脲)的稻杂草有明显功效(Kraehmer,et al.Herbicides as Weed Control Agents:Stateof the Art:I.Weed Control Research and Safener Technology:The Path to ModernAgriculture.Plant Physiology(2014).)。因此，β-三酮类除草剂常用于清除稻田的大多数阔叶类杂草和禾本科杂草，而研究表明，水稻对BBC的抗性候选基因为HIS1(HPPD抑制剂敏感型1)。HIS1编码351个氨基酸的Fe(II)/2-酮戊二酸依赖型加氧酶蛋白，BBC敏感型品种的第Ⅳ外显子缺失28bp，造成功能缺失(Maeda,Hideo,et al.A rice gene that confersbroad-spectrum resistance to β-triketone herbicides.ence 365.6451(2019):393-396.)。若能培育出对β-三酮类除草剂显性敏感的水稻，将会在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够有效抑制HPPD抑制剂敏感型1基因(HIS1)表达的植物表达载体及其构建方法。

为达到以上目的，本发明提供了一种抑制HIS1基因表达的RNAi植物表达载体，该载体含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQ ID No.1-3所示的DNA片段所形成的发卡结构。

其中，SEQ ID No.1所示的DNA片段为基于HIS1编码框的长度为243bp的正向DNA片段，SEQ ID No.3所示的DNA片段为基于HIS1编码框的长度为243bp的与SEQ ID No.1所示的DNA片段反向互补的DNA片段。SEQ ID No.2为来自水稻Zinc finger基因的内含子序列(Rice intron)。

SEQ ID No.1-3所示的DNA片段按照从上游到下游的方向依次排列。该发卡结构表达盒可在转化的植物细胞中转录形成发卡式的二级结构，SEQ ID No.2所示的DNA片段形成发卡的“环”，SEQ ID No.1和3所示的DNA片段互补形成发卡的“茎”。

其中，所述发卡结构表达盒还包括位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及，位于发卡结构下游的终止子。

其中所述植物组成型启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、Rubisco小亚基启动子、Cab启动子、CAMV 35S启动子或Actin启动子。优选的，当启动子为水稻或玉米的Ubi启动子时，能够取得非常强的干扰HIS1基因表达的效果。