[发明专利]一种基于CRISPR技术检测目标突变的方法

说明书

本发明提供了一种基于CRISPR技术检测靶核酸是否存在目标突变的方法，其特征在于，所述方法包括将样品与V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与突变型靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，所述目标突变设置于gRNA导向序列从5’端第10位、第11位、第12位和第13位中的一个或多个。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，涉及利用CRISPR技术检测目标突变，尤其涉及检测靶核酸是否存在目标突变和检测靶核酸在目标区域是否存在突变的方法、系统和试剂盒。

背景技术

特异性检测核酸分子(Nucleic acid detection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleic acid diagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。另一个方面是对人或其他物种的单核苷酸多态性(SNPs,singlenucleotide polymorphisms)的检测。在基因组水平上去理解遗传变异和生物学功能之间的关系为现代分子生物学提供了新视角，而其中SNPs对生物学的功能、进化和疾病等密切相关，因此SNPs的检测与分析技术的发展尤为重要。

目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术(SHERLOCK技术)，Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术(DETECTR技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术(HOLMES技术)。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。

本发明将CRISPR的核酸检测技术应用到检测靶核酸在目标区域是否存在突变和检测靶核酸是否存在目标突变中，具体的，提供给了高效的检测方法。

发明内容

本发明提供了一种基于CRISPR技术检测靶核酸是否存在目标突变位点和检测靶核酸在目标区域是否存在突变的方法、系统和试剂盒。

检测目标突变的方法

一方面，本发明提供了一种基于CRISPR技术检测靶核酸是否存在目标突变位点的方法，所述方法包括将靶核酸与V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与含有目标突变的突变型靶核酸杂交的导向序列，所述导向序列包括与所述目标突变位点配对的碱基；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号。

一种实施方式中，所述目标突变是野生型靶核酸与突变型靶核酸在gRNA导向序列所靶向区域内不一致的位点；由于gRNA的导向序列与突变型靶核酸杂交、包括与所述目标突变位点配对的碱基，此时，所述目标突变位点也是指gRNA导向序列与其所靶向的野生型靶核酸序列不一致的位点。

所述目标突变可以是单碱基突变、两个碱基突变、三个碱基突变或四个碱基突变；可以是连续的单碱基突变，也可以是不连续的单碱基突变。

在一个实施方式中，所述目标突变是单碱基突变，与所述目标突变位点配对的碱基设置于gRNA导向序列的5’端第10位、第11位、第12位和第13位中的的任一个；