[发明专利]蛹虫草菌活性RT-PCR检测引物和检测方法

说明书

本发明公开了一种蛹虫草菌活性RT‑PCR检测引物和检测方法，属于分子检测和鉴定技术领域。本发明引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。采用所述特异性引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2可有效地扩增蛹虫草菌的过氧化氢酶基因片段，片段大小341bp，用于RT‑PCR方法检测。检测结果采用2^‑ΔΔCT统计分析，与对照菌株相比，样品值/对照值为判断标准，比值大于或者等于1，该菌种可用于生产；0.1比值1，菌种活性较弱，使用时应谨慎；比值1/10时，该菌株基本不能用于蚕蛹虫草和虫草花的生产，检测结果能够预示蛹虫草菌的相对活性，为生产上菌种筛选提供技术依据。

技术领域

本发明涉及一种蛹虫草菌活性RT-PCR检测引物和检测方法，属于分子检测和鉴定技术领域。

背景技术

蛹虫草菌(Cordyceps militaris(L.)Link)属子囊菌亚门真菌，分离于野生蛹虫草菌，可用于生产虫草子实体和蚕蛹虫草，产品已被证明有多种功效。目前在中国、韩国等一些亚洲国家生产。随着生产技术的成熟和市场规模的扩大，制约虫草产业的问题很多，其中菌种活性不稳定影响生产是一个重要原因，不少生产企业因为菌种退化而造成生产损失，增加生产风险。Shrestha,B.等认为，虫草菌移植到F1和F2代，子实体和活性发生下降。生产企业目前普遍采用小规模栽培试验来鉴定菌种，非常费时费力。

随着分子鉴定技术的发展，虫草菌全基因序列已经公布，为开展多方面鉴定菌种活性奠定基础。较早研究虫草菌菌种活性差异的是利用RAPD，比较活性较好的菌株和活性较差的菌株试验，但这种方法存在很多缺点，不适合应用，但阐明了部分基因发生突变和表达功能减弱。Xiong,C.等利用转基因技术增强蛹虫草菌的抗氧化能力来延缓虫草菌的变性；林清泉等根据菌种产物的酸碱性判定菌种的活性，认为活性强的菌株分泌酸性物质，活性弱的菌株分泌能力减弱，酸性降低，用指示剂可以判定菌株的活性，他还研究了脱氢酶活性来判定菌种活性的方法；上海农科院报道了PCR判定菌株是否为虫草菌，未涉及活性判定。目前还没有一种快速有效的检测蛹虫草菌活性的方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明以蛹虫草菌过氧化氢酶基因片段为检测靶标，提供检测引物和采用RT-PCR检测方法和检测工艺应用于蛹虫草菌活性检测。

本发明的第一个目的是提供一种蛹虫草菌活性RT-PCR检测引物，所述的检测引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种蛹虫草菌活性RT-PCR检测试剂盒，所述的试剂盒内包括所述的蛹虫草菌活性RT-PCR检测引物。

进一步地，所述的试剂盒内还包括RT-PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷、ddH₂O、DNA聚合酶和cDNA合成反应体系。

进一步地，所述的cDNA合成反应体系包括通用引物(Oligo Primer)、脱氧三磷酸核苷、RT-PCR缓冲液、RNA酶抑制剂、逆转录酶和RNase free水。

本发明的第三个目的是提供一种蛹虫草菌活性RT-PCR检测方法，包括如下步骤：

S1、提取待检测样品RNA；

S2、将待检测样品RNA加入cDNA合成反应体系中，进行cDNA合成；

S3、将合成的cDNA加入到RT-PCR反应体系中进行RT-PCR反应，与对照进行比较，检测蛹虫草菌株活性。

进一步地，cDNA合成反应体系中，各成分含量如下：