[发明专利]一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒及其使用方法

说明书

本发明公开了一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒及其使用方法，包括靶向大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌16S rRNA中具有物种特异性序列的crRNAs，Cas13a蛋白，单链RNA探针，RNase抑制剂和缓冲液。本发明的试剂盒无需反转录及核酸序列扩增步骤，极大地降低了反转录可能造成的样品损失和核酸扩增可能造成的污染风险；操作步骤简单、恒温反应、无需热循环；检测时间不超过1小时，高效快速；可实现尿路感染病原菌16S rRNA定性检测与单分子水平检测定量检测，无需内参校正和建立标准曲线。

技术领域

本发明涉及病原菌检测领域，特别涉及一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒。

背景技术

尿路感染（Urinary Tract Infection，UTI）是临床常见的细菌性感染疾病，据统计人一生中约有50%的概率会经历尿路感染。尿路感染的95%以上是由单一细菌引起的，其中最常见的是大肠埃希菌，其次为粪肠球菌属、铜绿假单胞菌、葡萄球菌属细菌和肺炎克雷伯菌等。理想情况下，临床医生应当在获知患者的病原菌类型、含量的前提下，综合考虑感染部位、感染程度和患者生理、病理情况，给予针对性抗菌治疗方案（包括抗菌药物的品种、剂量、给药次数、给药途径、疗程等）。然而，当前尿路感染病原检测主要依赖尿培养和以此为基础的病原菌鉴定、菌落计数，此过程极为繁琐耗时，检测周期一般需要16-24小时甚至更长，因此目前尿路感染的诊治主要是通过临床症状评估结合经验性治疗来完成的。例如，针对尿路感染诊治的最新中国专家共识提出：根据患者的感染部位、发病情况、发病场所、既往抗菌药物用药史及其治疗反应等推测可能的病原体，同时结合当地细菌耐药性监测数据，先给予抗菌药物经验性治疗, 待获知病原学检测及药敏试验结果后，再结合先前的治疗反应调整用药方案。由于尿路感染临床症状的多样性和复杂性，而且在获得药敏试验结果之前经常采用经验性治疗或不规范的抗菌药物治疗所导致的尿路感染病原体的分布发生改变和耐药性的产生，使得现阶段尿路感染的诊治面临极大的挑战。因此，发展快速病原菌鉴定方法对于解决当前尿路感染所面临的挑战尤为重要。

原核生物体内普遍存在16S rRNA是其蛋白质合成所必需的一种核糖体RNA，一方面由于其包含了种属差异的特异性序列，可被作为细菌检测和鉴定的分子标志物，另一方面由于其相对丰度较高（通常为多拷贝甚至是成千上万拷贝），有利于提高细菌的高灵敏检出。因此，靶向16S rRNA的核酸检测可以实现快速尿路感染病原细菌的鉴定，可能避免冗长耗时的尿培养过程。然而，现有针对16S rRNA目的片段的高灵敏细菌检测主要依赖反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和相关等温扩增，包括RT-LAMP（逆转录环介导等温扩增），RT-RPA（重组酶聚合酶扩增技术），NASBA（核酸依赖性扩增技术），这些方法不可避免涉及了核酸的高度复制（上万倍），需要格外防备其导致的气溶胶污染和携带污染风险：包括建立隔离良好的物理隔间和空气交换系统等。这些要求很大程度上限制了现有核酸检测方法的广泛开展与应用。

发明内容

本发明为解决现有RNA定量检测技术存在的不足，提供一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方实现的：

一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒，包括靶向大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌属、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌16S rRNA中具有物种特异性序列的crRNAs，Cas13a蛋白，单链RNA探针，RNase 抑制剂和缓冲液。

进一步，所述crRNAs的序列如SEQ ID NO:2、4、6、8、10中的一种或多种所示。

进一步，所述缓冲液pH为8.9，包括以下组分：10 mM Tris-HCl、1.5 mM MgCl2、50mM KCl。

本发明还提供一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1：提取待测样本的核酸，得到核酸样本；