[发明专利]一种泛酸合成酶突变体的高通量快速筛选方法

说明书

本发明涉及一种泛酸合成酶突变体的高通量快速筛选方法。本发明以谷氨酸棒杆菌的泛酸合成酶为靶蛋白，利用饱和突变PCR技术对泛酸合成酶基因进行定向进化，突变基因重组于表达载体pET‑28a(+)中，并导入大肠杆菌BL21(DE3)构建突变体文库。取β‑丙氨酸及衍生化试剂于酶标板孔中，随即置于酶标仪中检测在激发波长355nm，发射波长445nm条件下的荧光值随时间的变化，曲线中最大值关联β‑丙氨酸的浓度，得到β‑丙氨酸标准曲线。通过计算得到反应液中β‑丙氨酸的浓度，以β‑丙氨酸浓度的高低来筛选泛酸合成酶突变体，使有效性状的突变株得以快速筛选出来。将缩合反应液、泛酸合成酶突变体全细胞反应液，充分混匀，反应结束后，离心除去细胞沉淀，取上清液和衍生化试剂反应，随即置于酶标仪中检测荧光值随时间的变化，本发明不受反应液中的杂质干扰，灵敏度和准确性高，重复性好，操作简便，便于推广应用。

(一)技术领域

本发明涉及一种泛酸合成酶突变体的高通量快速筛选方法。

(二)背景技术

泛酸，又称维生素B5，是活细胞中辅酶A合成的关键前体，是生命所必需的维生素。它可以由微生物和植物合成，但不能由人类和其他动物合成。因此，它已被广泛用作饲料和食品添加剂，以及化妆品和制药工业中的活性成分。特别是家禽家畜及鱼科类动物的生长发育、脂肪的合成和分解，都不可缺少对泛酸钙的需求。缺乏泛酸会导致家禽、家畜生长迟缓、生殖机能发生障碍、适应性降低。泛酸由泛解酸和β-丙氨酸经酶催化缩合而成，具有旋光性，仅D型具有生物活性。纯游离泛酸是一种黄色粘稠油状物，有酸性，易溶于水和乙醇，不溶于苯及氯仿。泛酸在酸、碱以及光、热条件下都不能稳定存在。泛酸一般是参加体内能量的制造，并且可以控制脂肪的新陈代谢，是大脑和神经的必需营养物质。目前国内外很多保健品都添加泛酸钙，如养生堂的“成人维生素”、“成长快乐”等。泛酸钙在此领域的消费需求增长最快。

目前，生产D-泛酸的方法有：①物理诱导结晶法，利用混旋泛酸钙的溶解度大于D-型或L-型这一特点进行诱导结晶，此方法工艺成熟，但只能生产泛酸钙，无法用于其他泛酸衍生物的生产。②化学拆分法，利用氯酶胺等手性拆分剂拆分，但拆分剂价格昂贵，分离困难，还存在毒性和环境污染问题。③微生物法，包含代谢工程法、发酵法和生物酶法，Zhang等利用代谢工程法生产D-泛酸，方法复杂，产量低，最高产量仅28.45g/L；发酵法的产量较高，但存在发酵产物成分复杂，不利于下游提取等问题，发酵过程中产生的物质对食品品质也会产生一定影响；生物酶法是利用泛酸合成酶(PS)催化D-泛解酸和β-丙氨酸进行缩合反应生成D-泛酸，反应条件温和，没有副产物的生成，更有利于产品分离。

微生物体内的D-泛酸生物合成比较复杂，它最后一步合成是在泛酸合成酶(panC)的催化下进行：一分子泛解酸和一分子β-丙氨酸消耗一分子ATP形成一分子泛酸。其中β-丙氨酸来源于天冬氨酸脱羧酶(panD)的催化作用，而泛解酸来源于缬氨酸合成途径的中间体α-酮异戊酸，α-酮异戊酸首先在羟甲基转移酶(panB)作用下生成酮泛解酸，后者在酮泛解酸还原酶(panE)或者酮酸还原异构酶(ilvC)作用下还原生成泛解酸。实际上，所有这些途径都使用泛酸合成酶(PS)缩合D-泛解酸和β-丙氨酸以生成D-泛酸。

然而，很少有研究集中在泛酸合成酶(PS)上，泛酸合成酶是生物生产D-泛酸的关键酶。泛酸合成酶(Pantothenate Synthetase)，由PanC基因编码。在ATP依赖下催化D-pantoate和β-alanine缩合形成泛酸，即维生素B5，在镁或者锰离子存在下该酶活性最好。到目前为止，在PDB库网站中可搜索到70个泛酸合成酶，其中包括1个空载(apo)结构和69个晶体复合物结构。PS蛋白序列全长含287个氨基酸，由A、B两条链组成，且该二聚体两个亚基结构一致。

现有技术筛选突变的PS主要通过将筛选对象即突变的PS作为合成D-泛酸的催化剂，通过检测D-泛酸的含量筛选PS突变体；检测D-泛酸主要通过高效液相色谱(HPLC)的方法，操作费时费力，效率低，不适用于PS突变体的高通量快速筛选，因此有必要研发一种泛酸合成酶突变体的高通量快速筛选方法。

(三)发明内容