[发明专利]一种泛酸合成酶突变体的高通量快速筛选方法

权利要求书

1.一种泛酸合成酶突变体的高通量快速筛选方法，所述方法包括：

(1)试剂配制：选取待筛选泛酸合成酶突变体单克隆，配制泛酸合成酶突变体全细胞反应液；配制β-丙氨酸的衍生化反应试剂；配制泛解酸盐缩合反应液；

(2)β-丙氨酸标准曲线的绘制：取β-丙氨酸及衍生化试剂，随即置于酶标仪中检测荧光值随时间的变化情况，以β-丙氨酸浓度为自变量x，荧光值为因变量y，绘制散点图，得到回归方程y＝ax+b，a为所得斜率；

(3)泛酸合成酶突变体酶活性的测定：取泛解酸盐缩合反应液和泛酸合成酶突变体全细胞反应液，充分混匀、反应结束后，离心除去细胞沉淀，收集反应上清液，稀释n倍至β-丙氨酸的浓度为0.01～10mM；

取稀释后的上清液和衍生化试剂进行反应，随即置于酶标仪中检测荧光值随时间的变化情况，确定β-丙氨酸的荧光值；

(4)筛选：根据待测样品上清液中β-丙氨酸的荧光值，对照β-丙氨酸标准曲线，计算得到反应液中β-丙氨酸的浓度，C_{(β-丙氨酸)}＝(荧光值+b)/a×n，以β-丙氨酸浓度的高低来筛选相应活性高低的泛酸合成酶的突变体，反应液中β-丙氨酸的消耗大于原始菌的10％及以上的突变体，为高活性突变体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述待筛选泛酸合成酶突变体来自泛酸合成酶突变库。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述泛酸合成酶突变体全细胞反应液按如下方法获得：选取待筛选泛酸合成酶突变体单克隆，接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm过夜培养；第二天吸取细胞培养液再转接到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，加入IPTG至终浓度为0.1mM，28℃诱导10h后停止培养；测OD600后离心，收集菌体，加入HEPES缓冲液重悬，-80℃保存。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述β-丙氨酸的衍生化反应试剂按如下组成配制：0.2M、pH9.5硼酸钠缓冲液，210mg/mL1,2-二乙酰基苯的甲醇溶液和5.7mg/mLβ-巯基乙醇的乙醇溶液按体积比1:1:1混合。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述泛解酸盐缩合反应液按如下组成配制：25mM D-泛酰内酯与25mMNaOH在室温下搅拌3h后，加入25mM β-丙氨酸、4.5mM ATP、10mMMgCl₂、15mMKCl，定容至200mL，调pH至8.0，2～4℃保存，现配现用。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)β-丙氨酸标准曲线的绘制方法如下：取0.089gβ-丙氨酸溶于10mL无菌水，分别稀释配制0、1、2、4、6、8、10mM β-丙氨酸工作液；在96孔板中加入2.5μL 0.2M、pH9.5硼酸钠缓冲液+2.5μL 10mg/mL1,2-二乙酰基苯的甲醇溶液+2.5μL5.7mg/mL β-巯基乙醇的乙醇溶液，马上置于酶标仪中检测荧光值随时间的变化情况，每4min读取一次，读取31次，记录荧光值的最大值关联β-丙氨酸的浓度；以β-丙氨酸浓度为自变量x，荧光值为因变量y，绘制散点图，得到回归方程y＝ax+b。