[发明专利]一种热稳定的苏氨酸脱氨酶及其应用

说明书

本发明实施例公开了热稳定的苏氨酸脱氨酶及其应用，属于生物化学技术领域，热稳定的苏氨酸脱氨酶，其源于Chryseobacterium takakiae的野生型苏氨酸脱氨酶，能够高温催化L苏氨酸生成2‑丁酮酸，能够应用于高温转化L苏氨酸制备L‑2‑氨基丁酸。本发明实施例公开来源于Chryseobacterium takakiae的野生型苏氨酸脱氨与大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶相比表现出更好的热稳定性，本发明的苏氨酸脱氨酶突变体在45℃‑60℃的活性更持久，用于2‑丁酮酸及L‑2‑氨基丁酸的制备，反应温度更高，底物溶解度更高故而可有效增加底物浓度，可有效加快动力学反应并提高生产效率。

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及一种热稳定的苏氨酸脱氨酶及其应用。

背景技术

L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种非蛋白氨基酸，具有抑制人体神经信息传递，加强葡萄糖磷酸酯酶的活性和促进脑细胞代谢的作用。L-2-氨基丁酸的衍生物(S)-2-氨基丁酰胺可做为新型抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦等手性药物的关键中间体，L-2-氨基丁酸的另一种衍生物(S)-2-氨基丁醇是抑菌抗结核药乙胺丁醇盐酸盐的关键中间体。这些药物的光学纯度对治疗的安全性和有效性至关重要。左乙拉西坦的R-对映体没有抗癫痫活性和(R，R)-形式的安非他命可引起失明。尽管乙胺丁醇和左旋乙拉西坦现在是仿制药，但在许多国家，高昂的药价造成大多数癫痫患者不能使用左乙拉西坦治疗。

目前，随着左乙拉西坦等药物专利到期，市场普及程度提高，对其关键中间体L-2-氨基丁酸需求越来越大。

L-2-氨基丁酸的生产方法主要有发酵法，化学合成法和生物催化法。发酵法现在存在的最大缺陷是产量低，产品纯度不够。目前的发酵法主要是针对苏氨酸代谢途径进行改造，使得代谢流向2-丁酮酸及-2-氨基丁酸，但报道出的数据均小于50克/升，结合L-2-氨基丁酸的市场价格现状(2018年四季度报价不足15美金)及市场容量(全球市场百吨级)，目前的发酵效价不太具有放大生产的意义。如专利CN201510208576.1中发酵后期要补入100g/L苏氨酸，10g/L谷氨酸，反应实质上仍是全细胞生物催化反应，且产物最高记录仅为57g/L左右，转化率偏低。CN201210015308.4在苏氨酸高产菌株的基础上，通过过表达苏氨酸脱氨酶与亮基酸脱氢酶发酵生成产物，但该方法发酵时间需要60小时，且产物最高记录仅为20g/L。另外微生物发酵过程中会产生大量的代谢产物并且发酵培养基中也会带入大量的有机培养基及无机盐，对分离造成一定程度的影响，进而导致最终产品的纯度及手性纯度低于体外催化途径。如CN201610208600.6专利中，发酵结束后经陶瓷膜，超滤膜过滤后，再经离子交换树脂吸附洗脱，纯度仅为97.3％，仍低于98.5％的普通级L-2-氨基丁酸纯度要求且离子交换树脂的使用对于L-2-氨基丁酸目前的价格并不具有实用意义。

化学法合成的产物多为消旋体，需要进一步拆分。另外，化学法需要使用昂贵的试剂，易生成副产物，同时使用多种有机溶剂，进一步增大了环保处理的成本。

生物催化法主要有氨基酰化酶法，氨基酸氧化酶法，酰胺酶法，腈水解酶法，转氨酶法和氨基酸脱氢酶法等。其中又以转氨酶法和氨基酸脱氢酶法的催化底物浓度及生产效率较高，目前市场上的生物催化法主要以这两类为主。转氨酶法是指2-丁酮酸在转氨酶的催化作用下合成2-氨基丁酸。利用α转氨酶合成时，由于反应的可逆性仅获得58％～62％的产率，并且该过程复杂，需要引入乙酰乳酸合成酶、丙氨酸外消旋酶和D-氨基酸氧化酶移除副产物。L-2-氨基丁酸还可通过ω-转氨酶以苄胺或异丙胺作为氨基供体合成，该反应不可逆，但目前所报道的ω-转氨酶法普遍底物浓度偏低。专利CN201510900727.X以胺和酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，生产手性胺，但转化浓度偏低，最高的数据仅为46g/L，距离工业放大生产仍有不小差距。