[发明专利]盐碱栽培条件下猴樟内参基因、引物及筛选方法

说明书

本发明公开了一种盐碱栽培条件下猴樟内参基因、引物及筛选方法，提供四个内参基因及对应的引物，以及通过引物从候选内参基因中确定最稳定的内参基因的方法，通过该基因、引物及筛选方法，可以综合分析认为四个内参基因可在盐碱栽培环境下的不同表型猴樟叶片中稳定表达，所设计的荧光定量PCR引物适用于猴樟响应盐碱胁迫时的基因表达分析，有利于提高盐碱胁迫下猴樟基因表达分析研究的稳定性和可靠性。

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及盐碱栽培条件下猴樟内参基因及其专用引物和应用。

技术背景

猴樟(Cinnamomun bodinieri Levl.)为樟科樟属常绿乔木，主要分布于我国南方地区，最早作为精油加工树种和林用树种进行研究和应用。樟属植物中香樟(C.camphora)很早就被作为优良的城市园林绿化树种进行研究和应用。通过一定的驯化措施,樟树已能经受住-14℃的短暂低温，樟树过江北移成为可能。但樟属植物在我国长江中下游地区及苏北地区的正常生长发育和产业化发展依然受盐碱土壤环境的影响，苗木栽植后通常表现为生长缓慢、叶片黄化、不能完全成活或存活1－2年开始死亡的现象。我们最近的研究初步认为部分猴樟表型比普通香樟具备更强的耐盐碱胁迫能力，进一步研究猴樟耐盐碱胁迫的分子机理，能为猴樟耐碱种质筛选提供依据。

基因表达分析是了解植物复杂生物学过程、代谢途径及信号转导分子机理的重要途径。实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)是目前已知基因研究的常用实验手段，具有操作简单、高通量等优点。然而，在实验过程中目的基因表达结果的准确性会受到RNA提取质量、逆转录效率等诸多因素的影响，为了得到更加准确可靠实验数据，需要一个或多个内参基因来进行校正和平衡。理想化的内参基因是一种在不同环境、不同个体或同一个体不同组织表达水平基本一致的看家基因(house keepinggene)。常用的看家基因主要包括18S核糖体RNA(18S rRNA)、25S核糖体RNA(25S rRNA)等核糖体RNA；肌动蛋白(Actin)、微管蛋白(tubulin beta,TUB)等细胞骨架结构蛋白和泛素(ubiquitin,UBQ)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glycer-aldehyde-3-phosphate,GAPDH)、泛素结合酶(ubiqui-tin conjugating enzyme,UBC)、翻译延长因子(transla-tion elongationfactor,TEF)、转录延伸因子(elongationfactor 1alpha,EF1α)等基本代谢所必需蛋白的编码基因。通常情况下不能保证看家基因在所有状态下都稳定表达，因此，为了保证定量PCR结果的可靠性，实验者需要根据不同试验材料、不同生长发育阶段或不同试验条件等因素筛选合适的内参基因。目前未见关于猴樟分子生物学研究，没有内参基因可以参考。

发明内容

本发明的目的在于提供一种盐碱栽培条件下猴樟基因表达谱中稳定表达的基因，以其作为猴樟响应盐碱胁迫分子机理研究的内参基因。

本研究以前期研究筛选出的在盐碱栽培条件下叶色表现不同的猴樟(YYHZ、HJHZ、HDHZ；YYHZ、HJHZ为耐盐碱表型，HDHZ为不耐盐碱表型)叶片组织为材料，以肌动蛋白actin1(ACT1)基因、泛素ubiquitin(UBQ)基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因、β微管蛋白基因(TUB)基因为候选内参基因，通过3个内参基因稳定性分析软件：geNorm，NormFinder以及BestKeeper分析候选内参基因的荧光定量数据，筛选出盐碱栽培条件下在不同猴樟表型叶片器官中表达最为稳定的内参基因，为猴樟的分子生物学研究提供支持。

本发明还提供了用于扩增所述的盐碱栽培条件下猴樟内参基因的实时荧光定量PCR专用引物及其应用。

本发明技术解决方案：