[发明专利]一种宫颈癌早期筛查检测试剂盒及其应用

说明书

本发明提供一种宫颈癌早期筛查检测试剂盒及其应用，通过采用亚硫酸氢盐修饰法对待测宫颈癌核酸样品进行亚硫酸氢盐转化，结合荧光定量PCR技术，综合分析文献研究结果、TCGA甲基化芯片数据库以及转录组测序表达谱，通过多重数据过滤分析，筛选宫颈癌高甲基化候选基因，针对宫颈癌高甲基化候选基因上的多个甲基化检测位点设计特异性的基因甲基化检测引物和探针，覆盖10个以上甲基化CpG位点，通过多重PCR扩增技术扩增经亚硫酸氢盐修饰的待测DNA样品，根据PCR扩增结果来确定待测样品中目标基因的甲基化情况，通过多种途径提高试剂盒的灵敏度与特异性，实现宫颈癌的早期筛查与诊断。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种组合物及其在疾病检测中的用途，具体地涉及一种宫颈癌早期筛查检测试剂盒及其应用。

背景技术

宫颈癌(cervical cancer)是女性最常见的生殖系统恶性肿瘤之一，在全球女性恶性肿瘤中居第二位，其发病率和死亡率仅次于乳腺癌，严重威胁女性身心健康。宫颈癌的发生几乎都是与高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染相关，发病年龄以40至50岁为最多，近年来发病有年轻化趋势。宫颈癌发生在子宫颈部位，多数为鳞癌，其次为腺癌、腺鳞癌，少见类型有小细胞癌、透明细胞癌等。宫颈癌早期一般没有任何症状，随着疾病的进展，才出现接触性出血、异常阴道流血等症状，需要主动筛查才会被发现。宫颈癌治疗效果与临床分期密切相关，早期癌宫颈癌通常有较好的预后，尽早发现宫颈癌可增加手术保留子宫的机会，提高总体生存率，早诊早治是提高治愈率的关键，同时宫颈癌有复发的可能性，因此预后监控亦要引起重视，如何尽早发现宫颈癌以及术后如何及时检测到宫颈癌的复发具有非常重要的临床意义。

目前宫颈癌的诊断技术有：1)宫颈刮片细胞学检查：易受到主观因素影响，有一定的假阴性率，容易漏诊；2)影像学技术：MRI检查、B超检查、CT检查，但对较小的肿瘤不够灵敏，无法进行明确诊断；3)阴道镜检查：肉眼并不能观察出是否癌变，对有阴道狭窄、宫颈表面坏死、出血的患者亦不适用；4)宫颈活体组织检查：该方法属于有创性检查，操作较复杂，对需要长期跟踪观察的患者，会造成身体不适，且经济负担较重。因此有必要开发一种无创的可靠的新型宫颈癌标识物和检测技术，提高宫颈癌早癌检出率，改善宫颈癌治疗效果，降低宫颈癌死亡率。

随着分子生物学技术的发展，表观遗传学在近年来肿瘤研究上越来越受到重视，DNA的甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA调控等表观遗传学改变都被认为与肿瘤的发生有着密切关系，其中DNA的甲基化是最为常见的表观遗传学改变，其可调控细胞增殖、凋亡与分化，且水平与肿瘤的生物学特性密切相关。目前研究表明宫颈癌患者特定基因的DNA甲基化改变(包括高甲基化和低甲基化)与已被证实的肿瘤特征有关，包括持续性增生信号的采集，抗细胞死亡，生长抑制的逃避，无限增生，炎症反应，能量代谢失调，诱导血管生成以及浸润激活。DNA甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变，因此DNA甲基化指标的检测可以作为癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标。

针对DNA甲基化检测方法大致可分为两类：全基因组甲基化分析和特异位点甲基化检测。全基因组甲基化分析检测成本较高，常作为一种高通量的筛选发现目标基因的手段；特异位点甲基化检测方法有联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化特异性PCR法(MSP)、甲基化荧光定量法(MethyLight)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法等，限制性内切酶分析法只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，甲基化特异性PCR法基于普通PCR及电泳分析操作繁琐且易造成样品污染，甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法对仪器要求较高，需要带高分辨率熔解(HRM)模块的荧光定量PCR仪，甲基化荧光定量法基于其高通量和高灵敏性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差，在DNA甲基化的检测中应用广泛。目前基于甲基化荧光定量法检测宫颈癌DNA甲基化方法中针对单个基因的检测精准度未如理想，诊断效果有限，研究者常通过组合多个基因的联合检测来提高检测灵敏度，但多基因联合检测可能会导致特异性的降低，同时若采用单管单基因测试的方式进行检测，需要消耗较多的试剂，增加实验人员的操作，实验成本较高。