[发明专利]一种鸭4型腺病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒

说明书

本发明涉及一种鸭4型腺病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒，本发明根据鸭4型腺病毒基因组保守序列设计引物组：外引物(X4‑F3和X4‑B3)、内引物(X4‑FIP和X4‑BIP)和环引物(X4‑LF和X4‑LB)，具体序列分别见SEQ ID NO.1‑6。根据所设计的引物组建立一种鸭4型腺病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。该试剂盒检测方法与鸭常见传染病病原不发生交叉反应。本发明的检测方法特异性强、准确性好、灵敏度高，无需昂贵仪器设备，便于基层临床现场使用，方便快速。

技术领域

本发明属于动物传染病学检测领域，具体涉及一种鸭4型腺病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。

背景技术

鸭4型腺病毒(duck adenovirus 4，DAdV-4)是2019年在我国南方地区新证实的一种鸭群新型腺病毒。对该病毒基因组进行分析发现，其主要基因编码蛋白均和鸭群中前期发现的鸭1型腺病毒、鸭2型腺病毒和鸭3型腺病毒相关基因的核苷酸和氨基酸同源性均低于80％。遗传进化分析表明，DAdV-4属于腺病毒科(Adenoviridae)禽腺病毒属(Aviadenovirus)，但处于一个独立的遗传进化分支，将其命名为鸭4型腺病毒(duckadenovirus 4，DAdV-4)。2020年，本研究团队在福建地区鸭群中也证实存在鸭4型腺病毒(DAdV-4)感染(命名为DAdV-4-FJ001株，GenBank登录号MW238795)，测定的DBP基因和鸭4型腺病毒参考株GD-2019株(GenBank登录号MN733730)核苷酸同源性为100％。

目前，在对新鉴定的传染病病原的检测方法主要是基于核酸水平的检测，如PCR方法、实时荧光定量PCR方法(real time PCR)和环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)反应等方法。但是普通的PCR方法以及灵敏度更高的荧光定量PCR方法，均需要使用精密仪器，对实验人员有较高的技术要求等，无法在基层实验室广泛使用。

2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)，中文名为“环介导等温扩增反应”。环介导等温扩增技术可在等温条件下进行高效、快速、高特异性的扩增靶序列。相对于现有的其他核酸扩增技术，LAMP具有许多独特的优点：①LAMP技术可以在等温条件下实现扩增，不需要进行模板的预变性，减少了PCR技术升降温带来的影响以及对昂贵、精密实验仪器的要求，同时扩增效率高。②LAMP技术扩增的特异性非常高，使用的特异性引物可以识别目的序列上特异性的区域，对目的序列具有高度的选择性，减少了非靶标序列的影响。③阳性扩增反应中会产生大量的类似花椰菜结构的产物和白色焦磷酸续沉淀，扩增产物的检测方法多样，可用凝胶电泳检测、直接用肉眼检测或在反应体系中加人染料，根据颜色的变化通过荧光照射装置进行紫外光照射检测；还可以利用浊度仪，根据扩增产物混浊度的不同对原始核酸分子进行实时定量分析。此外，LAMP方法还具有特异性强，灵敏度较PCR方法高，无需PCR仪器等贵重仪器，仅需要普通水浴锅调节温度(60℃～65℃)，特别适合基层和现场使用。目前，还未见针对鸭4型腺病毒环介导等温扩增(LAMP)反应方法的相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白，建立的LAMP检测方法及其试剂盒对后续开展鸭4型腺病毒分子流行病学和科学防控该病具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸭4型腺病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。利用该引物组可以特异性的检测鸭4型腺病毒，为基层和现场提供一种简便、快捷的检测鸭4型腺病毒的方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种鸭4型腺病毒环介导等温扩增检测引物组，其由外引物(X4-F3和X4-B3)、内引物(X4-FIP和X4-BIP)、环引物(X4-LF和X4-LB)组成，上述引物序列如下：

X4-F3：5’-GATGTGTTCGGTACCACTCAA-3’，