[发明专利]果糖-二磷酸酶突变体及其在碳水化合物合成中的应用

说明书

本发明涉及基因工程和酶工程领域，具体涉及果糖‑二磷酸酶突变体及其在碳水化合物合成中的应用。本发明的果糖‑二磷酸酶突变体能够解除ADP和ATP在合成碳水化合物中的抑制作用，因而可以用于C6化合物和Cn化合物的合成。实验表明，本发明的突变体在应用于以二羟基丙酮为原料时合成C6化合物，产量提高近10倍；在合成Cn化合物方面，产量提高4倍以上。

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程领域，具体涉及果糖-二磷酸酶突变体及其在碳水化合物合成中的应用。

背景技术

果糖-二磷酸酶(FBP，EC 3.1.3.11)是参与糖酵解和糖异生途径的关键酶，催化1,6-二磷酸果糖(F1,6-2P)转化为6-磷酸果糖(F-6-P)。FBP激活糖异生途径促使碳通向磷酸戊糖途径并增加NADPH的水平，可用来产生各种理想的代谢产物，如脂肪酸和固醇类物质的合成。同时，糖异生途径中产生的F-6-P可以用来生产果糖、葡萄糖、阿洛酮糖、塔格糖等许多小分子碳水化合物甚至淀粉(如图5所示)。

不同中间代谢产物对FBP活性有不同程度抑制作用，不利于小分子产品及碳水化合物的合成，我们发现辅因子ADP和ATP严重抑制FBP酶活性，通过对酶结构分析，进行定点突变后解除了抑制作用，大幅提高合成C6化合物和Cn化合物的产量及合成速度。

农业种植是目前生产淀粉的唯一方式。农作物中淀粉的天然合成途径包括卡尔文循环，共涉及二十几个化学反应和中间代谢产物以及多个细胞器。有报道称可以实现一碳到三碳化合物的合成，而从三碳化合物合成六碳甚至淀粉体系中，FBP作为关键酶，解除辅因子ADP和ATP对其抑制作用，使得一碳到多碳化合物的体外合成成为了可能，对于生产小分子碳水化合物和开发能够替代农业种植生产淀粉的方法将具有重要意义。

体外合成生物学通过合理地人工组装不同来源的酶/酶复合物、辅酶和酶载体等，在体外构建催化体系，模拟胞内的催化过程或者完全按照人工设计的催化途径来实现体外合成。相比于化学催化方法，体外生物合成具有立体选择性高、反应条件温和、污染低等优点；相比于传统的发酵过程和农业种植，体外合成体系具有反应速率快、目标产物得率高、对有毒物质的耐受性强、设计灵活等优势。

发明内容

本发明提供了果糖-二磷酸酶突变体，其在特定位点的突变可以解除ADP和ATP对活性的抑制作用，该突变体在以二羟基丙酮为原料，合成C6化合物和Cn化合物的应用中，合成速度及产量大大提高。

因此，本发明提供一种果糖-二磷酸酶突变体，其相对于如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的野生型果糖-二磷酸酶而言，其第104位赖氨酸突变为谷氨酰胺，且第132位精氨酸突变为异亮氨酸。野生型的果糖-二磷酸酶酶活受ADP和ATP抑制作用明显，所示突变体一定程度上解除了ADP和ATP的抑制作用。

进一步的，在上述突变的基础上，第210位酪氨酸突变为苯丙氨酸，以及第218位赖氨酸突变为谷氨酰胺，获得果糖-二磷酸酶突变体。该突变体在上述突变的基础上同样可以解除ADP和ATP的抑制作用。

本发明提供上述的果糖-二磷酸酶突变体的编码基因。优选地，核苷酸序列如SEQID NO：3或SEQ ID NO：4所示，以及含有所述编码基因的表达盒，表达载体及重组细胞。

本发明进一步提供上述的果糖-二磷酸酶突变体或其编码基因在碳水化合物合成中的应用。