[发明专利]合成高谷氨酸的工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种合成高谷氨酸的工程菌，其特征在于，包括：宿主菌和转入该宿主菌的质粒载体，该质粒载体中导入了编码赖氨酸酮戊二酸还原酶、酵母氨酸脱氢酶和α‑氨基己二酸半醛脱氢酶的基因。所述宿主菌还敲除ldcC和cadA基因，整合dapA突变基因与lysC突变基因为T7强启动子，敲除了pgi基因，还整合了谷氨酸棒杆菌中多功能酶的编码基因ddh到dapD基因所在位置，并在ddh基因的上游整合T7强启动子。所述重组质粒载体上还连接有MscCG基因。本发明还提供一种上述合成高谷氨酸的工程菌的构建方法和应用。利用上述合成高谷氨酸的工程菌，以葡萄糖为碳源来生产高谷氨酸，实现了高谷氨酸的高效生物合成。

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种合成高谷氨酸的工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

高谷氨酸即α-氨基己二酸(α-Aminoadipic acid)，是一种非蛋白氨基酸，分子量161.16，分子式C₆H₁₁NO₄，白色结晶体或者白色结晶粉末，是合成有机膦羧酸类药剂α-氨基己二酸-N，N-二甲叉膦酸，抗风湿药甲氨蝶呤衍生物以及青霉素和头孢菌素等β-内酰胺抗生素的前体。还可用作生理活性肽(如肽抗生素和肽激素)的末端修饰剂。高谷氨酸对星形胶质细胞具有特异毒性，是研究星形胶质细胞在发育和疾病中的作用的重要工具。现阶段高谷氨酸的合成依赖于化学合成法，生物合成的方法并没有相关报道。

目前合成高谷氨酸主要为化学合成法，主要有三条合成路线。第一条路线：以3-氰基丙醛为原料，在哌啶存在条件下和N-乙酰基-2-硫代乙内酰脲反应，再与磷、氢碘酸加热，最后通过水解得到产物；该方法的成本较高，收率低，不适合工业化生产。第二条路线：以2-氨基-6-羟基-己酸(赖氨酸)作为原料，由于原料成本较高，应用价值不高。第三条路线：以2-N-乙酰基-6-6氨基己酸乙酯作为原料，收率为60％。由此可见，采用化学方法合成高谷氨酸存在成本髙、收率低以及环境污染等问题，因此，有必要寻找一种新的方法来合成高谷氨酸。

发明内容

有鉴于此，本发明确有必要提供一种合成高谷氨酸的工程菌及其构建方法和应用，以解决上述问题。

本发明的主要目的是从大量生物或微生物体内能够合成高谷氨酸的酶中筛选出在体外依然具有催化效率的酶来实现高谷氨酸的异源合成。为此，本发明选择了来源于细菌的赖氨酸酮戊二酸还原酶、酵母氨酸脱氢酶和α-氨基己二酸半醛脱氢酶的相关基因，通过酶的表达，构建合成高谷氨酸的工程菌，实现联合赖氨酸生物合成高谷氨酸，进而实现利用简单碳源从头生物合成高谷氨酸。

为了实现上述目的，本发明提供了一种合成高谷氨酸的工程菌，包括：宿主菌和转入该宿主菌的质粒载体，该质粒载体中导入了编码赖氨酸酮戊二酸还原酶、酵母氨酸脱氢酶和α-氨基己二酸半醛脱氢酶的基因。

基于上述，所述宿主菌中敲除了编码赖氨酸脱羧酶基因的ldcC和cadA。所述合成高谷氨酸的工程菌中的宿主菌敲除了ldcC和cadA基因，能够抑制赖氨酸合成尸胺，减少了赖氨酸的损耗。

基于上述，所述宿主菌中包括编码天冬氨酸激酶的lysC突变基因和编码4-羟基-四氢二吡啶甲酸合酶的dapA突变基因，其中，所述lysC突变基因是将lysC原始基因中的第352位苏氨酸(Thr)突变为异亮氨酸(Ile)，所述dapA突变基因是将dapA原始基因中的第118位组氨酸(His)突变为酪氨酸(Tyr)。进一步，所述宿主菌在进行重组的过程中，lysC突变基因与dapA突变基因的启动子为T7强启动子。所述宿主菌中包括lysC突变基因和dapA突变基因，可以有效解除赖氨酸对基因表达的反馈抑制作用。

基于上述，所述宿主菌中同时还敲除了糖酵解途径中编码葡萄糖磷酸异构酶的基因pgi。