[发明专利]从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法

说明书

本发明公开了从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法，本发明是一种超高灵敏度的从水体中检测无乳链球菌的方法，该方法的灵敏度可达到1‑10CFU/10ml。通过本发明的方法，可以在无乳链球菌大面积感染鱼体之前，就从水体中检出无乳链球菌是否存在，如果存在，立刻采取池塘消毒，投喂抗生素等措施对疾病进行预防，由于处理手段是在疾病发展的最初期实施，因此防止罗非鱼患病效果非常明显。

【技术领域】

本发明涉及DNA片段检测技术领域，具体涉及从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法。

【背景技术】

罗非鱼是世界上养殖最广泛的鱼类之一，具有生长快、抗病力与抗逆性强、肉质好、繁殖力强、适应性广以及群体产量高等一系列优点，全球产量仅在2013年就达到450万吨。在我国，罗非鱼现已成为南方各省出口型养殖规模最大的鱼类，产量占全世界的50％，罗非鱼产业对于增加就业机会、提高农民收入都有十分重要的意义。

尽管罗非鱼在差水质中耐受力比其他淡水鱼更好，但随着水产养殖活动的广泛开展，近年来，由于高密度饲养，种群退化，加上养殖水质、环境及气候恶化，各类病害时常大面积爆发，严重影响到罗非鱼产业的健康发展。罗非鱼养殖业受到了各种各样的病原体的影响，最为突出的就是链球菌，链球菌病的病原菌主要是无乳链球菌和海豚链球菌，具有发病率高和死亡率高的特点，会造成巨大经济损失。2009-2011年，国内主要的罗非鱼养殖区爆发了非常严重的罗非鱼流行病，患病罗非鱼在水面离群独游，游姿失衡，眼球突出，被养殖户形象的称为“突眼病”，该病发病率一般达20-30％，死亡率在95％以上。病原分析表明引起罗非鱼“突眼病”的病原为链球菌，主要为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。据统计，近几年因链球菌病导致罗非鱼产业的损失达20亿元，如何防治罗非鱼链球菌病已成为农业和渔业管理部门最为关注的问题。

目前，已经有一些新技术被应用于罗非鱼链球菌的诊断：

分子诊断技术是当代医学发展的重要前沿领域之一，主要包括免疫诊断技术和分子生物学诊断技术，二者都具有操作简便、快速、准确、特异性强、阳性率高的特点。免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应，检测病原微生物，简化了病原微生物的鉴定步骤，备受关注。各大文献数据库提供的数据显示，几乎建立了所有病原体的血清学检测方法，表明该方法已成为一种微生物实验室常用的成熟的检测技术，具有操作简便、快速、准确、特异性强、阳性率高等特点。免疫学方法中常见的几种诊断技术包括凝集技术、荧光抗体技术、酶联免疫技术等。随着分子生物学技术的迅速发展，使人们对微生物的认识从外部表型逐渐转向内部基因结构特征，微生物的检测也从生化、免疫方法转向基因水平检测，对于那些难培养和不可能培养的微生物，可直接通过获得基因信息，给微生物学的检测带来崭新的领域。分子生物学诊断技术中常用的方法有PCR技术、核酸分子杂交、多位点序列分型、环介导等温扩增技术等。同免疫诊断试剂相比较，分子生物学诊断试剂具有生产工艺简单，灵敏度更高的特点，逐渐成为新一代分子诊断试剂开发的主流。

CAMP因子是无乳链球菌特异性产生的一种蛋白质，是无乳链球菌区别于其他细菌的重要特征指标。在传统的无乳链球菌生理生化鉴定中，CAMP试验已成为鉴定无乳链球菌的关键试验。CAMP因子的编码基因是cfb基因，利用分子生物学技术检测样品中是否含有cfb基因即可判断样品是否受到了无乳链球菌的感染。

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30-60min，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，能不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测。