[发明专利]从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法

权利要求书

1.从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)取1000ml池塘水，平均装入4个250ml离心管中，离心；

2)去掉上清液，每管留10ml的液体，与沉淀重悬均匀，将4管重悬液装入50ml离心管中，离心，去掉上清，留1-2ml的液体，与沉淀重悬均匀；

3)提取上步骤重悬液的总DNA，并以所提取总DNA为模板，进行PCR扩增，扩增无乳链球菌cfb基因片段；

所用引物序列为P1：5-TATCTGGAACTCTAGTGGCTG-3，P2：5-TGACGTTAAGTACTTTTTTATC-3；

反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，扩增片段大小为605bp；

4)将上步骤反应液稀释100倍，以稀释液为模板，进行实时荧光PCR；

所用引物序列为P3：5-GCTGGTGCATTGTTATTTTCAC-3，P4：5-CAATAGAATTCAAATCATAA-3；

反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，扩增片段大小为271bp，反应过程中实时观察荧光信号，根据荧光信号判断水体中是否存在无乳链球菌；

5)对检测结果为阳性的池塘进行针对性处理，处理步骤如下：

(1)第1天：使用二氧化氯进行消毒；

(2)第2天-第3天：投喂抗菌药物；

(3)第4天：使用二氧化氯进行消毒。

2.根据权利要求1所述的从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法，其特征在于：步骤1)和步骤2)所述的离心，是8000rpm离心10min。

3.根据权利要求1所述的从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法，其特征在于：步骤2)所述的进行实时荧光PCR，是采用染料法进行实时荧光PCR。

4.根据权利要求1所述的从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法，其特征在于：步骤5)所述的使用二氧化氯进行消毒，二氧化氯使用量为1亩水体，按1米水深计，使用有效含量6-8％的二氧化氯泡腾片400g。

5.根据权利要求1所述的从养殖水体中检测无乳链球菌以防止罗非鱼患病的方法，其特征在于：步骤5)所述的投喂抗菌药物，投喂标准是每10000斤鱼投喂25g复方磺胺嘧啶，按药物有效含量计，药物溶于水后拌料投喂，每天投喂一次，连续2天。