[发明专利]一种早期鉴定中国甜柿自然脱涩性状的引物和鉴定方法

说明书

本发明公开一种早期鉴定中国甜柿自然脱涩性状的引物和鉴定方法，上游引物和下游引物，如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；鉴别方法包括如下步骤：提取柿属植物个体的DNA；利用所述的上游引物和下游引物对所提取的DNA模板进行PCR扩增；PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像仪下拍照；根据电泳图中的条带情况对中国甜柿自然脱涩性状进行鉴定。本发明提供的分子标记在分子遗传上与甜、涩性状共分离，鉴别准确率达到95％以上，可广泛用于以完全甜柿为育种目标的早期分子标记辅助育种，可以简便、快速、高效地应用于柿属植物的育种实践。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域。具体地说是一种早期鉴定中国甜柿自然脱涩性状的引物和鉴定方法。

背景技术

柿(Diospyros kaki Thunb.)为柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros)植物，有“木本粮食”之称。柿属植物集食用、药用、用材及观赏价值于一体，柿果实营养丰富，风味独特，可鲜食也可制成柿饼食用，柿蒂、柿根、柿叶等可入药，清热解毒、护肝降压；树干可以作为建筑用材；柿果成熟后色泽鲜艳、形状各异，可作为良好的观赏树种。

柿根据能否在果实硬食期自然脱涩性可分为完全甜柿和非完全甜柿。完全甜柿包括中国甜柿和日本甜柿，中国甜柿自然脱涩性状由显性单基因控制，主要表现为单宁凝固效应，而日本甜柿自然脱涩性状是由隐性单基因控制，主要表现为单宁稀释效应。完全甜柿无需人工脱涩即可鲜食，长久以来一直作为柿育种的重要目标，杂交育种是品种改良和种质创新的重要方式，以中国甜柿作为杂交亲本更有利于获得完全甜柿新种质。柿树童期长，通过杂交获得的新种质，从幼苗繁育到结果后选育优良品系耗时较长，且所需费用较高。因此，有必要开发与中国甜柿自然脱涩性状相关的分子标记，将完全甜柿新种质在育苗阶段筛选出来，通过高接方法可以快速结果，从而节约时间和成本，加速育种进程，提高了种质创新与利用效率。

现有技术中已有分子标记因扩增片段长度较短导致的对中国甜柿鉴定不稳定、不准确，缺乏高效的PCR引物及PCR扩增条件，使得对中国甜柿自然脱涩性状的鉴定存在不准确问题，同时也没有建立一套实际操作方法。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效的早期鉴定中国甜柿自然脱涩性状的引物和鉴定准确率高、稳定的早期鉴定中国甜柿自然脱涩性状的鉴定方法。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种早期鉴定中国甜柿自然脱涩性状的引物，包括上游引物和下游引物，如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

一种早期鉴定中国甜柿自然脱涩性状的鉴定方法，包括如下步骤：

(1)提取柿属植物个体的DNA；

(2)利用上述的上游引物和下游引物对所提取的DNA模板进行PCR扩增；

(3)PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像仪下拍照；

(4)根据电泳图中的条带情况对中国甜柿自然脱涩性状进行鉴定。

上述一种早期鉴定中国甜柿自然脱涩性状的引物和鉴定方法，在步骤(1)中：

(1-1)用电子天平迅速称取0.5g的柿树幼嫩叶片于研钵中，利用液氮将样品充分研磨成粉末；

(1-2)迅速转入盛有预热至65℃的800μL的溴化十六烷基三甲铵CTAB缓冲液的1.5ml离心管中，65℃水浴提取30min；

(1-3)加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿和异戊醇体积比为24：1，涡旋混匀后在12000rpm的转速下离心10min，将上清液转入新的离心管，再次加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，涡旋混匀后在12000rpm的转速下离心10min；