[发明专利]一种早期鉴定中国甜柿自然脱涩性状的引物和鉴定方法

权利要求书

1.一种早期鉴定中国甜柿自然脱涩性状的引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

2.一种早期鉴定中国甜柿自然脱涩性状的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取柿属植物个体的DNA；

(2)利用权利要求1所述的上游引物和下游引物对所提取的DNA模板进行PCR扩增；

(3)PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像仪下拍照；

(4)根据电泳图中的条带情况对中国甜柿自然脱涩性状进行鉴定。

3.根据权利要求2所述的一种早期鉴定中国甜柿自然脱涩性状的鉴定方法，其特征在于，在步骤(1)中：

(1-1)用电子天平迅速称取0.5g的柿树幼嫩叶片于研钵中，利用液氮将样品充分研磨成粉末；

(1-2)迅速转入盛有预热至65℃的800μL的溴化十六烷基三甲铵CTAB缓冲液的1.5ml离心管中，65℃水浴提取30min；

(1-3)加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿和异戊醇体积比为24：1，涡旋混匀后在12000rpm的转速下离心10min，将上清液转入新的离心管，再次加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，涡旋混匀后在12000rpm的转速下离心10min；

(1-4)取上清液于新的离心管后，加入等体积且预冷至-20℃的异丙醇，缓慢摇匀至DNA絮状沉淀析出；10000rpm离心10min，倒去上清液；

(1-5)用体积分数为70％的乙醇清洗沉淀物2-3次；

(1-6)室温放置5min使沉淀物自然风干后，加入预热至65℃的50μL的TE缓冲液，即得到柿基因组DNA；

(1-4)利用1.0％琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度计法检测DNA样品的纯度和浓度，样品检测合格后置于-20℃冰箱保存备用。

4.根据权利要求2所述的一种早期鉴定中国甜柿自然脱涩性状的鉴定方法，其特征在于，在步骤(2)中，PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，49.4℃退火30s，72℃延伸30s，变性退火延伸共35循环，最后72℃延伸10min。

5.根据权利要求2所述的一种早期鉴定中国甜柿自然脱涩性状的引物和鉴定方法，其特征在于，在步骤(2)中，PCR扩增体系为25μl，反应组成为12.5μL的2x Taq PCR MasterMix，10μM/L的上游引物和下游引物各0.1μL，基因组DNA模板为100-200ng，最后加入ddH₂O补至25μL。

6.根据权利要求2所述的一种早期鉴定中国甜柿自然脱涩性状的引物和鉴定方法，其特征在于，在步骤(3)中，电泳分离的条件为：90V 40min，4S Red Plus染色，Marker为DNA分子量标准为100-2000bp；采用BIO-RAD Gel Doc XR凝胶成像仪下拍照。

7.根据权利要求2所述的一种早期鉴定中国甜柿自然脱涩性状的引物和鉴定方法，其特征在于，在步骤(4)中，电泳凝胶上420bp处显示1条条带的对应的个体即为具有自然脱涩性状的中国甜柿；420bp处无条带的为不具有自然脱涩性状的中国甜柿。