[发明专利]一种核酸印迹磁珠的制备方法及其应用

说明书

本发明一种核酸印迹磁珠的制备方法及其应用，属于分子生物学技术领域；本发明模拟分子印迹技术通过聚合反应制备了对核酸(DNA/RNA)具有特异性吸附的靶向磁珠，所述的印迹磁珠的制备方案主要以核酸为基本组成单元，核苷酸作为模板分子，以含有双键的小分子为功能单体和偶联剂，通过乳液聚合的方式制备。该磁珠在核酸提取过程中能极大提高对核酸的选择性，降低磁珠对盐和蛋白的非特异性吸附，提高靶分子核酸的提取效率。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种核酸印迹磁珠的制备方法及其应用。

背景技术

核酸提取和纯化是下游PCR、测序(NGS)、分子杂交的重要步骤，核酸的提取量和提取纯度直接影响下游检测灵敏度和特异性，传统的核酸提取方法有溶剂萃取和硅胶柱法提取，这两种方法中均含有离心和沉淀的过程，样本需求量大，耗费样品较多，对于某些微量样品的检测受到很大的局限，同时离心柱法的特点，使其无法实现高通量、自动化的操作，在样品量大的血液筛查、突发疫情等领域受到极大的限制，另外，由于上述过程操作过程复杂、耗时耗力，提取过程中核酸损失较多，导致核酸的回收率较低，而且用到的硅胶柱法提取特异性差，导致核酸提取率低，影响下游的扩增和测序，导致假阳性的出现。

磁珠法进行DNA提取是近几年发展起来的一种核酸提取技术，是纳米科技与生物技术的完美结合，与上述提取方法相比，最大的优势就是可以实现高通量的提取，尤其在血液筛查、临床乙肝、突发疫情等领域，同时，磁珠法自然沉降和离心过程，简化了传统DNA提取操作流程，不需要用大量有毒试剂等，操作简单方便。

专利号：201510241587.X发明了一种磁性微球的制备方法。该方法使用铁离子和亚铁离子，制备得到磁流体，再加入甲基丙烯酸甲酯等制备微球。使用的引发剂为过硫酸钠或偶氮二异丁酸二甲酯。该发明制备的微球生物相容性好，能够在基因测序的过程中用于酶的固定，但是该法制备的磁流体属于共沉淀法，制备的磁流体磁性弱，磁流体团聚，在后续利用甲基丙烯酸甲酯修饰的时候制备的磁珠粒径均一性较差。

专利号：201510610883.2发明了一种用于动物组织核酸提取的磁性微球，该磁性微球先通过聚碳硅烷包覆纳米级磁性粉体，再通过热处理和磁选手段制得。该磁性微球粒径均一可控，比表面积大，具有超顺磁性，可快速高效分离提纯动物组织核酸，但是该磁性微球对核酸的选择性差。

传统的核酸提取磁珠主要是利用羟基或羧基通过盐桥或氢键形式对核酸进行提取，因提取过程中对蛋白和盐存在非特异性吸附，降低了磁珠对核酸的提取量，同时为了降低蛋白和盐对下游扩增的抑制，核酸提取过程中需要将磁珠进行两步洗涤，洗涤过程中容易造成核酸的损失，使得核酸的回收率下降。

发明内容

本发明目的在于提供一种核酸印迹磁珠的制备方法及其应用，以解决现有技术中的磁性微球磁性弱、磁流体团聚对核酸的选择性差的技术问题。

为实现上述目的，本发明的一种核酸印迹磁珠的制备方法及其应用的具体技术方案如下：

本发明提供一种用于提取核酸的印迹磁珠的制备方法，模拟分子印迹技术通过聚合反应制备了对核酸(DNA/RNA)具有特异性吸附的靶向磁珠，所述的印迹磁珠的制备方案主要以核酸的基本组成单元：核苷酸(Monophosphate,MP)作为模板分子，以含有双键的小分子为功能单体和偶联剂，通过乳液聚合的方式进行制备。

所述核酸印迹提取磁珠的制备工艺包括，四氧化三铁表面双键修饰、印迹聚合和模板洗脱三个部分，详细制备方法如下：

一、双键改性：