[发明专利]一种富集目标区域再酶切构建单倍型的方法

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种富集目标区域再酶切构建单倍型的方法，所述方法包括以下步骤：1)富集目标核酸区域；2)设计仅能与目标核酸区域中的一个单倍体结合的向导序列，利用向导序列以及限制性核酸内切酶酶切步骤1)富集的目标核酸区域，分别回收酶切片段和/或未被酶切的片段；3)利用步骤2)回收的酶切片段和/或未被酶切的片段分别制备测序文库并测序，数据分析分别得到酶切片段和/或未被酶切的片段的核酸序列的SNP信息，即为目标核酸区域的单倍型信息。本发明的方法可以靶向基因组上一个较小区域且实验操作简便、成本低。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种富集目标区域再酶切构建单倍型的方法。

背景技术

人是二倍体生物，即含有两组染色体，单组染色体即为单倍体。在单倍体中，紧密连锁的多个等位基因的线性组合，每种组合方式即为一种单倍型。单倍型可以由多个SNP位点构成，包含丰富的遗传信息，研究单倍型比单个SNP位点具有更好的分析效果，更能有效反映出疾病的遗传机制，其在遗传病检测领域有着广泛的需求。

遗传信息的变异是所有基因组的共同特征，而单碱基对的差异，也称单核苷酸多态性(SNP)是变异中最常见的一种形式，占所有已知多态性的90％以上。SNP位点并不是独立遗传的，而是在染色体上成组地遗传。一般来说，一个SNP位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据，因此被广泛用于群体遗传学研究和疾病相关基因的研究，在药物基因组学、诊断学和生物医学研究中起重要作用。

基因分型(Phasing)还称为基因定相、单倍体分型或单倍体构建。基因分型是指把二倍体(甚至是多倍体)基因组上的等位基因(包括杂合位点，例如SNP)，按照其亲本正确地定位到父亲或者母亲的染色体上，最终使得所有来自同一个亲本的等位基因都能够排列在同一条染色体里。

目前单倍型分析技术主要分为两大类，间接推断法和直接实验法。间接推断法是借助计算机通过统计学方法，从参考基因组中推断出样本单倍型。随着新一代测序技术的快速发展，人们可以比较容易获得大量的基因组信息，这是间接推断法的基础。间接推断法根据研究对象的不同又可分为两类：群体推断法和家族推断法。群体推断法是通过构建一些关联群体的基因池并用统计学方法对预测结果进行分析推断样本的单倍型。如果群体中存在一些突变频率较低的个体，它受连锁不平衡程度的影响往往会被遗漏而无法获得其单倍型信息。家族推断法是根据同一家族众多个体的基因型信息对待测样本进行推断获得其单倍型信息，在使用前要确保同一家族中这些样本基因型信息的可靠性。总之，间接推断法需要依靠大量样本的支持，并不是针对个体样本的单倍型分析，准确性受到不同算法的影响较大。

直接实验法是指用单分子稀释、染色体微切割和流式分离法等特殊实验方法在一段有限的染色体区域或单染色体获得精确的单倍型信息。直接实验法又可分为两大类：稠密位点单倍型(Dense)法和稀疏位点单倍型(Sparse)法。

稠密位点单倍型法能精确检测到单染色体局部区域的单倍型，组装结果更完整，在染色体上的排布较密集，是目前最为常用的方法。它主要包括单分子稀释法(Single-molecule dilution)、长片段插入克隆法(Long-insert cloning)、保留邻近性转座酶测序法(Contiguity-preserving transposition sequencing，CPT-seq)、目标位点扩增(Targeted locus amplification，TLA)等。然而这些方法多是针对全基因组的单倍型组装，需要大量的测序数据，成本非常高，同时实验操作复杂，流程长，在数据分析阶段依赖如hapcut2这类软件的复杂算法。