[发明专利]一种富集目标区域再酶切构建单倍型的方法

权利要求书

1.一种构建单倍型的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)富集目标核酸区域；

2)设计仅能与目标核酸区域中的一个单倍体结合的向导序列，利用向导序列以及限制性核酸内切酶酶切步骤1)富集的目标核酸区域，分别回收酶切片段和/或未被酶切的片段；

3)利用步骤2)回收的酶切片段和/或未被酶切的片段分别制备测序文库并测序，数据分析分别得到酶切片段和/或未被酶切的片段的核酸序列的SNP信息，即为目标核酸区域的单倍型信息。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，与所述向导序列互补的核酸模板片段上仅有一个杂合SNP位点。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述向导序列满足以下条件中的一项或几项：

1)所述向导序列的对数为一对或多对；

2)每对向导序列包括正链和负链，所述正链和负链均为5’端被磷酸化的单链DNA；

3)杂合SNP位点对应向导序列的第8～14位；

4)所述向导序列的长度为10nt～40nt；优选的，长度为13nt～25nt。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，杂合SNP位点对应向导序列的第10～12位。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述向导序列的正链和负链的5’端第一个碱基均为T。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中酶切时的酶切体系中包括：目标核酸区域的扩增产物、限制性核酸内切酶、向导序列和缓冲液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以酶切体系的总体积为基准，所述酶切体系中扩增产物的浓度为4ng/μl～8ng/μl；优选的，扩增产物的浓度为5～7ng/μl。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以酶切体系的总体积为基准，所述酶切体系中限制性核酸内切酶的终浓度为0.045～3.84μM；优选的，限制性核酸内切酶的终浓度为0.225-1.92μM。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以酶切体系的总体积为基准，所述酶切体系中向导序列的正链和负链的终浓度分别为0.45μM～38.4μM；优选的，正链和负链的终浓度分别为2.25～19.2μM。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述限制性核酸内切酶为PfAgo。