[发明专利]一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法

说明书

本发明公开了一种高产β‑葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，一种高产β‑葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法包括如下步骤：首先配置培养基及试剂，再活化出发菌种，再对种子进行培养，然后液体发酵培养，再制备单孢子菌悬液，确定最佳诱变时间之后进行对菌株进行ARTP诱变，将诱变得到的菌株进行高通量初筛和摇瓶复筛,最后将得到的高产菌株进行遗传稳定培养。本方法选用黑曲霉作为出发菌株，相较发酵周期更短、β‑葡萄糖苷酶产量更高；采用ARTP诱变技术，相较于传统诱变技术，本方法具有操作简便、成本低、无有毒有害物质参与诱变过程等优点；通过p‑NPG比色法和DNS法相结合的方法进行高产菌株的筛选，得到的高产菌株更加适合工业化发酵生产β‑葡萄糖苷酶。

技术领域

本发明涉及一种黑霉素的选育方法，具体为一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，属于纤维素酶水解技术领域。

背景技术

β-葡萄糖苷酶是一种纤维素酶类水解酶，广泛存在于各类生物体中，作用于芳基或羟基与糖基原子团之间的糖苷键，生成β-D－葡萄糖及相应配基。β-葡萄糖苷酶是纤维素酶中的一种，可促进纤维二糖的水解，提高纤维素酶系的水解活性，在纤维素降解过程中发挥着关键作用，如果缺少β-葡萄糖苷酶就会造成纤维二糖的大量积累，而纤维二糖的大量积累又会对纤维素酶的酶解形成强烈的反馈抑制，所以增强纤维素酶体系中β-葡萄糖苷酶的活力是提高纤维素水解效率和增加葡萄糖产量的关键，为了更好地对β-葡萄糖苷酶发酵工艺和酶学特性开展研究，需要一种提取大量且酶活性高的β-葡萄糖苷酶的方法。

提取β-葡萄糖苷酶的现有技术主要有三种，方法一是从各种植物和微生物中分离纯化出β-葡萄糖苷酶，但通过该方法提取的β-葡萄糖苷酶，其酶活力较低、成本高；方法二是利用微生物发酵来生产β-葡萄糖苷酶，但该方法筛选得到的产酶菌株大部分产酶量较低；方法三是通过传统诱变技术选育出β-葡萄糖苷酶高产菌株，虽然该方法使野生型菌株的产酶水平有了很大幅度的提高,但是,到目前为止,仍未选育出能够适合于工业化发酵生产β-葡萄糖苷酶的菌株。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，其特征在于：所述一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法包括如下步骤：

S1、培养基及试剂的配制，准备斜面培养基、种子培养基、初筛培养基、液体发酵培养基、葡萄糖标准溶液、缓冲溶液、水杨苷溶液、适量的DNS试剂以及相应的实验仪器。

S2、出发菌种的活化，将保藏的黑曲霉菌种划线接种于PDA培养基上，置于培养箱中28℃恒温培养96h。

S3、种子培养，取一环新鲜成熟的斜面培养基上的孢子，接入50mL种子培养基中，在28℃恒温摇床中，以180r/分钟的转速培养种子液24h。

S4、液体发酵培养，取发酵好的种子培养基，按照10％的接种量，将种子液接入250mL装有50mL液体发酵培养基的锥形瓶中，在30℃、180r/分钟的条件下进行培养。

S5、制备单孢子菌悬液，将培养成熟的种子试管斜面加入5mL无菌生理盐水，用接种环轻轻地将孢子刮下，装入装有玻璃珠的100mL锥形瓶中，25℃150r/分钟震荡30分钟。然后用灭菌后的脱脂棉将锥形瓶中的菌液过滤，制得单孢子悬浮液。通过血球板计数，最终将孢子液制成浓度约为10⁶个/mL的混悬液。

S6、确定最佳诱变时间，将出发菌株分别处理1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟，将诱变后的菌悬液涂布在PDA平板上，以28℃的温度在恒温培养箱中培养4-5天，待长出菌落后，通过菌落数计算菌株的致死率，并绘制出致死率曲线，然后根据不同诱变时间对黑曲霉的ARTP致死率影响，确定最佳诱变时间。

S7、ARTP诱变，用移液枪吸取10微升单孢子菌悬液滴加至载片中央，用无菌镊子将载片放于ARTP系统操作室旋转台上的对应孔位，并对其进行ARTP诱变处理，诱变时间为S8所确定的最佳诱变时间。