[发明专利]一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法

权利要求书

1.一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，其特征在于：所述一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法包括如下步骤：

S1、培养基及试剂的配制，准备斜面培养基、种子培养基、初筛培养基、液体发酵培养基、葡萄糖标准溶液、缓冲溶液、水杨苷溶液、适量的DNS试剂以及相应的实验仪器；

S2、出发菌种的活化，将保藏的黑曲霉菌种划线接种于PDA培养基上，置于培养箱中28℃恒温培养96h；

S3、种子培养，取一环新鲜成熟的斜面培养基上的孢子，接入50mL种子培养基中，在28℃恒温摇床中，以180r/分钟的转速培养种子液24h；

S4、液体发酵培养，取发酵好的种子培养基，按照10％的接种量，将种子液接入250mL装有50mL液体发酵培养基的锥形瓶中，在30℃、180r/分钟的条件下进行培养；

S5、制备单孢子菌悬液，将培养成熟的种子试管斜面加入5mL无菌生理盐水，用接种环轻轻地将孢子刮下，装入装有玻璃珠的100mL锥形瓶中，25℃150r/分钟震荡30分钟。然后用灭菌后的脱脂棉将锥形瓶中的菌液过滤，制得单孢子悬浮液。通过血球板计数，最终将孢子液制成浓度约为10⁶个/mL的混悬液；

S6、确定最佳诱变时间，将出发菌株分别处理1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟，将诱变后的菌悬液涂布在PDA平板上，以28℃的温度在恒温培养箱中培养4-5天，待长出菌落后，通过菌落数计算菌株的致死率，并绘制出致死率曲线，然后根据不同诱变时间对黑曲霉的ARTP致死率影响，确定最佳诱变时间；

S7、ARTP诱变，用移液枪吸取10微升单孢子菌悬液滴加至载片中央，用无菌镊子将载片放于ARTP系统操作室旋转台上的对应孔位，并对其进行ARTP诱变处理，诱变时间为S8所确定的最佳诱变时间；

S8、高通量初筛，将制备好的单孢子菌悬液利用ARTP在最佳诱变时间下诱变后，利用微液滴器接种在装有种子培养基的24微孔板中，于30℃，200r/分钟条件下培养12h，然后在无菌条件下，取培养好的种子液10L加入含有底物p-NPG的发酵培养基的96孔板中培养48h,并喷洒Na₂CO₃，最后挑选有明显黄色圈的菌落，作为高产菌株进入下一轮筛选中；

S9、酶的活性验证，将上述96孔微孔板在4000r/分钟的条件下离心，取上清液5L稀释了适当倍数的粗酶液，于50℃水浴预热10分钟，然后加入100L已预热10分钟的5mmol/Lp-NPG溶液，10分钟后再立即加入1mol/L的Na₂CO₃溶液200L直至终止反应，再将其放置5分钟，最后利用酶标仪测出吸光值；

S10、摇瓶复筛，将高通量初筛的高产菌株进行平板划线分离纯化后，进行摇瓶复筛，通过DNS法来测定所筛选菌株产β-葡萄糖苷酶酶活的能力，酶活大的菌株即为高产菌株；

S11、遗传稳定培养，将高产菌株进行传代培养10代，再进行发酵培养。

2.根据权利要求1所述的一种高产β一葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，其特征在于：所述S1中的斜面培养基为PDA培养基，且所述PDA培养基由200g马铃薯、20g琼脂以及20g葡萄糖配置而成，所述种子培养基由0.5g磷酸二氢钾、10g硫酸铵、1g七水硫酸镁以及10g葡萄糖配置而成，所述初筛培养基由固含量为20％的土豆汁、浓度为2％的蔗糖、灭菌冷却后的p-NPG配置而成，所述液体发酵培养基由20g麸皮、1g硫酸铵、2g磷酸二氢钾、0.2g七水硫酸镁以及0.2g七水硫酸亚铁配制而成，所述初筛培养基和液体发酵培养基均保持自然PH，无需调PH值。