[发明专利]用于表达rFC蛋白的59R突变载体及其制备方法和应用

权利要求书

1.用于表达rFC蛋白的载体，其特征在于，所述载体是在piggyBac 载体骨架上插入DsRed 表达单元与CFib-H 表达单元构建得到的，所述CFib-H 表达单元由 PFib-H家蚕重链基因启动子 、突变型增溶标签sNTD59R、his蛋白标签和rFC的表达基因组成；所述CFib-H表达单元的连接方式为 PFib-H-sNTD59R-his-rFC；所述DsRed 表达单元为由3xP3启动子引导的红色荧光DsRed 基因组成；

所述突变型增溶标签sNTD59R的蛋白序列如序列表SEQ：NO：1所示。

2.根据权利要求1用于表达rFC蛋白的载体，其特征在于，所述载体的核酸序列如序列表SEQ：NO：3所示。

3.一种表达rFC蛋白的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求1或2任意一项所述载体。

4.一种应用如权利要求1或2任意一项所述用于表达rFC蛋白载体来分泌rFC蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）构建所述用于表达rFC蛋白的载体；

（2）采用显微注射的方法将步骤（1）的载体注射到蚕卵的胚子发育区；

（3）将步骤（2）的蚕卵孵化饲养成虫后，筛选红眼表型纯一的蛾进行连续3代的饲养，选出不产生性状分离的第3代蚕进行饲喂，育成红眼基因纯合、rFC蛋白纯合且丝腺细胞能够分泌rFC蛋白的转基因蚕；

（4）rFC蛋白在蚕丝素蛋白重链信号肽的作用下分泌到蚕的丝腺腔，并分泌到蚕茧。

5.根据权利要求4所述的分泌rFC蛋白的方法，其特征在于，所述步骤（2）蚕卵的注射时间为蚕卵产下后的4-8h。

6.根据权利要求4所述的分泌rFC蛋白的方法，其特征在于，所述步骤（2）蚕卵的注射时应将针孔从蚕卵的“D”型区凸面推入。

7.一种制备如权利要求1或2任意一项所述用于表达rFC蛋白的载体的方法，其特征在于，所述方法为：

（1）下载蜘蛛蛋白的sNT序列，将序列进行氨基酸序列突变，最终得到并合成的突变氨基酸序列如序列表SEQ：NO：1所示；

（2）提取鲎的血液，通过RT-PCR的方法扩增rFC蛋白基因，并对该蛋白进行密码子改造，改造后编码的氨基酸序列如序列表SEQ：NO：2所示；

（3）将SEQ：NO：1、SEQ：NO：2、his蛋白标签和荧光表达基因连接在piggyBac 载体骨架上即得所述载体，最终得到的载体核苷酸序列如序列表SEQ：NO：3所示。