[发明专利]基于NGS技术的结核分枝杆菌耐药性检测试剂盒及方法

说明书

本发明涉及一种基于下一代测序技术的结核分枝杆菌耐药性检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括引物序列、DNA提取液，荧光定量PCR反应液，引物组。可直接在痰液中的结核分枝杆菌开展关键核心位点序列分析，通过500多对引物直接在痰液中结核分枝杆菌的多重引物PCR测序。所述方法包括下述步骤：痰液样品前处理、基因组提取‑CATB法、引物组构建基因组文库，DNA测序仪测序。所述方法为全基因组测序在分枝杆菌的临床应用开发了可行的技术平台。

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体而言，本发明涉及一种结核分枝杆 菌检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

基于WHO global tuberculosis reports对临床结核病分子诊断的最新 要求，结核分枝杆菌全基因组测序技术作为分子诊断能够提供基因组最 全信息的技术方法必然是未来的发展趋势，而且现在NGS的费用不断 降低，测序技术不断发展，包括测序仪的成本不断降低，未来将会完全 占领分子诊断市场。即使我们现在产品的成本，依然可以在市场上具有 很强的竞争力。

目前WHO global tuberculosis reports中对结核分枝杆菌测序分析技 术主要来自于培养后的结核分枝杆菌，但痰培养结核分枝杆菌需4～8 周，然后建库测序，尽管给出了大量的信息，但不利于临床诊断。为了 结核病诊断的临床应用，最佳的方案是从痰液中直接分析结核分枝杆菌 基因组信息，但痰液中DNA成分复杂，很难开展全基因组测序技术获 得所需的结核分枝杆菌相关信息，即使获得，成本也较高。由此，我们 优化痰液中total DNA的提取方法，高度浓缩了结核分枝杆菌基因组关 键核心部分，通过500多对引物的多重PCR技术+NGS的测序方法，给 出分子诊断相关的结果和预测(1)是否存在结核病感染(2)结核分枝 杆菌种系鉴定(3)结核病一线抗结核药物(异烟肼、利福平、乙胺丁醇 以及吡嗪酰胺)药敏预测(4)超级结核菌传播群/簇的发现。相关结果 可以满足现在WHO对结核分枝杆菌全基因组测序的要求。

发明内容

本申请利用2019年WHO将全基因组测序准备全面推向结核分枝 杆菌耐药及流行病学鉴定之际(Global Tuberculosis reports,2019)，创先 直接在痰液中的结核分枝杆菌开展关键核心位点序列分析，通过500多 对引物直接在痰液中结核分枝杆菌的多重引物PCR测序。截至2020年 8月，临床无相关服务及产品可以同时快速获得结核菌定性及耐药、流 行病学分析检测报告，用于诊断和用药指导。本项目开发的产品从痰液 样本进行检测，满足WHO最新的检测要求。同时也可实时更新，满足 其对未来精准、快速、全面分析的要求。项目为全基因组测序在分枝杆 菌的临床应用开发了可行的技术平台，为临床产品的开发、升级提供了 足够的拓展空间。

本申请的目的之一在于提供一种试剂引物。

本申请的另一目的在于提供一种试剂盒。

本申请的另一目的在于提供一种检测方法。

为解决上述问题，本申请采取以下技术方案：

一种结核分枝杆菌检测引物组，其包括下述引物：

上游引物

和

下游引物