[发明专利]基于NGS技术的结核分枝杆菌耐药性检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌基因突变耐药性检测引物组，其特征在于包括下述引物组：

上游引物组

和

下游引物组

2.一种结核分枝杆菌耐药性基因突变检测试剂盒，其特征在于包括：由引物序列，苯酚:氯仿:异戊醇溶液，醋酸钠，异丙醇，磷酸盐缓冲液，NALC-NaOH缓冲液，磷酸盐缓冲液，乙醇，CTAB溶液，GTE溶液，蛋白酶K，RNA酶，DNA聚合酶，磁珠，磁力架和权利要求1所述引物组组成。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述引物序列包括rrs,rpoC,rpoB,rpoA,pncA,KatG,kasA,iniC,iniB,iniA,gyrB,gyrA,ethR,ethA,eis,ahpC。

4.一种结核分枝杆菌检测方法，其特征在于包括下述步骤：痰液样品前处理、基因组提取-CATB法、权利要求1所述的引物组构建基因组文库，DNA测序仪测序。

5.根据权利要求4所述的结核分枝杆菌检测方法，其特征在于：所述痰液样品前处理包括下述步骤：

1)收集2-3ml痰液样品，加入等体积的NALC-NaOH缓冲液，在室温孵育15min,至样品明显液化；

2)用0.067M的磷酸盐缓冲液(pH6.8)补齐样品总体积到50ml，彻底混匀，室温5000rpm离心15min,去上清，保留沉淀；

3)将位于50ml离心管底部的残留液充分混匀，并转移至1.5ml离心管中，80℃加热20min，-20℃冻存，冰域运输。

6.根据权利要求4所述的结核分枝杆菌检测方法，其特征在于：所述基因组提取-CATB法包括下述步骤：

1)取一定量的菌液于离心管中，室温13000rpm，10min；

2)去除上清，用450μl GTE溶液重悬细胞，加50μl的10mg/ml溶菌酶；

3)充分混匀，于37℃孵育过夜；

4)加2:1体积的100μl的10％SDS和50μl的10mg/ml蛋白酶K，轻轻混匀，在55℃下孵育20-40min；

5)全部吸取菌液转移至Lysing Matrix Tubes(Lysing Matrix B 0.1mm silicaspheres)中，于MPFastPrep-24仪上振荡破菌：工作4.0M/S,30S，暂停5min，Lysing MatrixTubes置于冰浴，总共振荡5次；

6)加入10μl RNaseA，37℃孵育10-30min；

7)加入200μl的5M NaCl，轻轻混匀；

8)在65℃下预热CTAB，加160μl的CTAB溶液，轻轻混匀，65℃孵育10min；

9)加入等体积的25:24:1(V/V)苯酚:氯仿:异戊醇溶液，混匀，离心5min；

10)吸取上清，并转移到另一个新的离心管中；

11)重复9-10步骤；

12)将上清移到一个新的2ml离心管中，加入3M的醋酸钠20μl，再加入0.7倍体积异丙醇，轻轻颠倒，此时应看到絮状的沉淀；将离心管至于-70℃冰箱30min以上；

13)待完全融化，温度达到室温后，室温离心10min，12000rpm；

14)小心吸尽上清，注意不要吸到沉淀DNA；

15)加1ml 70％乙醇洗DNA，轻轻混匀，来回颠倒数次后，12000rpm，10min；

16)小心吸出上清，不要吸到DNA沉淀，然后将离心管置于干净的地方，空气干燥15min，等到管中沉淀DNA由白色变为透明为界限，注意不要过分干燥；

17)加入40μl的ddH₂O(60℃)溶解DNA，一小时或者过夜后，以0.8％-1％琼脂糖电泳检测样品质量，测OD值。