[发明专利]一套石蒜育性相关EST-SSR标记的开发与应用

说明书

本发明提供一种基于转录组数据开发性状相关联分子标记的方法，属于分子标记研究领域。本发明根据石蒜近缘种——忽地笑转录组序列的GO功能注释，选择参与激素信号通路、花器官和种子形成以及控制生长模式转换的EST序列，开发了21个EST‑SSR标记。该套引物组来源于可能影响育性的功能基因，将其应用于石蒜种质的遗传分析，能够有效地将石蒜可育和不育材料区分开来，并且5个位点LrES4、LrES15、LrES17、LrES18和LrES21表现为与育性极显著的相关性，表明它们在开发石蒜育性选择标记的巨大潜力。

技术领域

本发明涉及一套育性相关EST-SSR标记，属于分子标记技术领域。

背景技术

石蒜为石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属多年生草本植物，具有重要的药用价值和观赏价值。其不仅含有石蒜碱(lycorine)、加兰他敏(galanthamine)、水仙环素(narciclasine)等多种具有特定药理活性的石蒜科生物碱，还具有重要的观赏价值，夏可观花，秋可观叶。由于石蒜基因组庞大，且可供利用的分子标记很少，尚无任何公布的连锁标记，因而石蒜资源的品种改良和分子育种大大落后。因此，开发石蒜特定性状相关的分子标记是目前在不具备任何连锁图谱条件下挖掘性状关联标记的高效手段。

基于表达序列标签(Express Sequence Tag,EST)库或转录组测序数据开发的SSR标记(简单重复序列)，称之为EST-SSR标记。由于其来源于转录的功能基因，其对应基因的功能注释有利于挖掘性状相关联的EST-SSR标记，大大提高性状相关联分子标记的开发速度和效率，为石蒜资源开发利用以及分子育种提供研究基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一套开发特定性状相关EST-SSR标记的方法，进一步以石蒜育性为研究对象开发的一套育性关联的EST-SSR标记，该套标记包含8个与响应激素的标记，8个与花器官和种子形成有关的标记和5个参与营养生长和生殖生长的转换的标记。本发明提供了一套石蒜EST-SSR分子标记，所述石蒜EST-SSR标记是21个引物对。

该套引物序列依次如下，SEQ ID NO.:1至SEQ ID NO.:42。

表1与激素相关石蒜EST-SSR引物特征(SEQ ID NO.:1～16)

表2花和种子发育相关的石蒜EST-SSR引物特征(SEQ ID NO.:17～32)

表3与生长模式转换相关的EST-SSR引物特征(SEQ ID NO.:33～42)

本发明的21个石蒜EST-SSR标记是通过以下方法开发的：

(1)本发明基于石蒜近缘种——忽地笑的转录组数据库，根据序列的GO功能注释，选择参与激素调控、花器官和种子发育以及生长模式转换的EST序列，利用MISA软件寻找SSR位点，进而设计引物在石蒜中扩增验证；

(2)用CTAB(十六烷基三乙基嗅化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取石蒜基因组DNA；