[发明专利]一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法

说明书

本发明公开了一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，包括如下步骤：步骤S1：重组质粒构建；步骤S2：感受态细胞制备；步骤S3：质粒的线性化；步骤S4：电转化；步骤S5：阳性克隆的菌落PCR鉴定及克隆的小量转接；步骤S6：阳性克隆的诱导及小量表达测试；步骤S7：放大纯化；在基因合成的过程中对hEGF的基因进行了密码子的优化，且后期的表达小试进行了最优克隆的筛选及最优表达时间的优化，因此极大地提高了该蛋白的表达量，缩短了蛋白质纯化时间至2h，极大地保障了蛋白活性；通过将重组hEGF质粒转化至毕赤酵母GS115宿主细胞中，利用甲醇诱导，最终通过离子交化层析得到高纯度的目的蛋白。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法。

背景技术

表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，简称EGF)是广泛存在于哺乳动物体内的一类多肽物质。是由53个氨基酸组成的小分子多肤，分子量约为6KDa，等电点约为4.6，分子内有三对二硫键，因而对酸、碱、热等理化因素均较稳定。具有广泛的生物学效应，能极强地促进各种表皮组织生长，在医学上己用于烧烫伤、溃疡、各类创伤以及角膜损伤等的治疗，EGF还能促进正常表皮细胞的新陈代谢，添加到美容护肤品中可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作用，现有的重组hEGF在制备过程中蛋白表达量低，且纯化时间较长，纯化效果一般。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法。

本发明要解决的技术问题：

现有的重组hEGF在制备过程中蛋白表达量低，且纯化时间较长，纯化效果一般。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，包括如下步骤：

步骤S1：重组质粒构建；

步骤S2：感受态细胞制备；

步骤S3：质粒的线性化；

步骤S4：电转化；

步骤S5：阳性克隆的菌落PCR鉴定及克隆的小量转接；

步骤S6：阳性克隆的诱导及小量表达测试；

步骤S7：放大纯化。

进一步，步骤S1的具体步骤如下：

步骤S11：通过基因合成技术将重组hEGF密码子优化后亚克隆至pPIC9K中，构建重组hEGF质粒；

重组hEGF质粒的基因序列为:

MNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGGGGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGGGGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR*。

进一步，步骤S2的具体步骤如下：

步骤S21：将毕赤酵母菌株用含有50μg/mL chloramphenicol的YPD培养基进行活化后，在含有50μg/mL chloramphenicol的YPD固态培养基上划线，筛选出三个单克隆菌落，分别接种至3个含有50μg/mL chloramphenicol的YPD液态培养基的50mL离心管中，在温度为30℃，摇床转速为220r/min的条件下，进行过夜培养，得到克隆菌体；