[发明专利]一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法在审
| 申请号： | 202011210233.6 | 申请日： | 2020-11-03 |
| 公开（公告）号： | CN112358537A | 公开（公告）日： | 2021-02-12 |
| 发明（设计）人： | 雍金贵;王方平;潘楠;鲍伟 | 申请（专利权）人： | 安徽环球基因科技有限公司 |
| 主分类号： | C07K14/485 | 分类号： | C07K14/485;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84 |
| 代理公司： | 合肥正则元起专利代理事务所(普通合伙) 34160 | 代理人： | 周卫 |
| 地址： | 239000 *** | 国省代码： | 安徽;34 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 重组 hegf 酵母 中的 生产 方法 | ||
1.一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤S1：重组质粒构建；
步骤S2：感受态细胞制备；
步骤S3：质粒的线性化；
步骤S4：电转化；
步骤S5：阳性克隆的菌落PCR鉴定及克隆的小量转接；
步骤S6：阳性克隆的诱导及小量表达测试；
步骤S7：放大纯化。
2.根据权利要求1所述的一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，其特征在于：步骤S1的具体步骤如下：
步骤S11：通过基因合成技术将重组hEGF密码子优化后亚克隆至pPIC9K中，构建重组hEGF质粒；
重组hEGF质粒的基因序列为：MNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGGGGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGGGGSMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR*。
3.根据权利要求1所述的一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法，其特征在于：步骤S2的具体步骤如下：
步骤S21：将毕赤酵母菌株用含有50μg/mL chloramphenicol的YPD培养基进行活化后，在含有50μg/mL chloramphenicol的YPD固态培养基上划线，筛选出三个单克隆菌落，分别接种至3个含有50μg/mL chloramphenicol的YPD液态培养基的50mL离心管中，在温度为30℃，摇床转速为220r/min的条件下，进行过夜培养，得到克隆菌体；
步骤S22：将挑选步骤S21得到的克隆菌体中长势最好的菌体至灭过菌的1.5mL离心管中，加入500μL已灭菌的体积浓度为50％的甘油，混合均匀后，在温度为-20℃的条件下，进行保温备用，制得第一克隆菌液；
步骤S23：将步骤S22制得的第一克隆菌液50μL接种至含有50μg/mL chloramphenicol的YPD液态培养基中，在温度为30℃的条件下，过夜培养至OD600为1.3-1.5，制得第二克隆菌液；
步骤S24：将离心机预冷至4℃，将步骤S23制得的第二克隆菌液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃的灭菌水50mL重悬沉淀，得到第一悬浮液；
步骤S25：将离心机预冷至4℃，将步骤S24制得的第一悬浮液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃的灭菌水25mL重悬沉淀，得到第二悬浮液；
步骤S26：将离心机预冷至4℃，将步骤S25制得的第二悬浮液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃已灭菌的1M山梨醇25mL重悬沉淀，得到第三悬浮液；
步骤S27：将离心机预冷至4℃，将步骤S26制得的第三悬浮液，在转速为3000r/min的条件下，进行离心5min，去除上清，用预冷至4℃已灭菌的1M山梨醇500μL重悬沉淀，得到第四悬浮液，将第四悬浮液分装至预冷至4℃的已灭菌的1.5mL离心管中，每管100μL，在-80℃的条件下，进行冻存，制得感受态细胞。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于安徽环球基因科技有限公司，未经安徽环球基因科技有限公司许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/202011210233.6/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
- 上一篇：一种重组限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法
- 下一篇：热水器及其控制方法
