[发明专利]一种表达腺苷蛋氨酸合酶的枯草芽孢杆菌及应用

说明书

本发明公开了一种表达腺苷蛋氨酸合酶的枯草芽孢杆菌及应用，属于基因工程技术领域。本发明在枯草芽孢杆菌异源表达酿酒酵母来源的腺苷蛋氨酸合酶，并通过启动子适配性改造，构建了一株高水平表达腺苷蛋氨酸合酶的枯草芽孢杆菌。进一步通过对其进行发酵条件优化，提高其腺苷蛋氨酸合酶表达水平，使重组菌的酶活高达0.925U·mLsupgt;‑1/supgt;，较出发菌株提高了180％，也是首次SAM合酶以枯草芽孢杆菌作为宿主的表达。

技术领域

本发明涉及一种表达腺苷蛋氨酸合酶的枯草芽孢杆菌及应用，具体涉及利用枯草芽孢杆菌异源表达酿酒酵母来源的腺苷蛋氨酸合酶，属于基因工程技术领域。

背景技术

腺苷蛋氨酸(S-Adenosyl-L-methionine,SAM)是一种存在于生物体中的必须分子，是蛋氨酸的一种活性形式，在体内为氨基酸、蛋白质和DNA等物质的合成充当甲基供体，它也是谷胱甘肽(Glutathione,GSH)转硫和多胺合成过程中必不可少的前体物，因此它在人体中有着至关重要的作用，S-腺苷蛋氨酸主要用于医疗行业，在肝脏、骨关节炎以及神经疾病治疗方面表现突出。

枯草芽孢杆菌是目前用于目的蛋白异源表达的常用宿主。与大肠杆菌相比，该宿主细胞壁中没有能引发炎症的内毒素，是常用的食品安全性菌株。并且该菌株生长所需培养基相对简单，可在大量获得目的蛋白的同时尽可能降低生产成本，是适合工业化生产的菌株。因此，目的蛋白SAM合酶可能适合在枯草芽孢杆菌中表达。为了尽可能积累目的蛋白，将B.subtilis168的六个胞外蛋白酶基因敲除获得菌株B.subtilis WB600，该菌株已成功对多种外源蛋白进行了异源表达，如角蛋白酶、海藻糖酶、转谷氨酰胺酶等，但是尚无文献报道SAM合酶在枯草芽孢杆菌中的表达。

发明内容

本发明提供了一种在枯草芽孢杆菌中异源表达酿酒酵母来源的腺苷蛋氨酸合酶并提高其表达量的方法，在枯草芽孢杆菌中异源表达腺苷蛋氨酸合酶的基础上，通过启动子适配性改造，构建一株高水平表达腺苷蛋氨酸合酶的枯草芽孢杆菌，并对其进行发酵条件优化，进一步提高其腺苷蛋氨酸合酶表达水平。

本发明的第一个目的是提供编码腺苷蛋氨酸合酶的基因，含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供携带所述基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述表达载体为质粒pMA5。

在一种实施方式中，所述表达载体含有启动子trnQ、sigX、yolA、gapB、cdd、veg、epr、aprE、bpr、nprB、pst、gsiB或srfA。

本发明的第三个目的是提供一种产腺苷蛋氨酸合酶的重组枯草芽孢杆菌，表达了SEQ ID NO.1所示的腺苷蛋氨酸合酶。

在一种实施方式中，所述腺苷蛋氨酸合酶是由SEQ ID NO.2所示的基因编码的。

在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌通过启动子trnQ、sigX、yolA、gapB、cdd、veg、epr、aprE、bpr、nprB、pst、gsiB或srfA表达所述腺苷蛋氨酸合酶。

在一种实施方式中，所述启动子trnQ的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；启动子sigX的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；启动子yolA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；启动子gapB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；启动子cdd的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；启动子veg的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；启动子epr的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；启动子aprE的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；启动子bpr的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示；启动子nprB的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；启动子pst的核苷酸序列如SEQID NO.13所示；启动子gsiB的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；启动子srfA的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。