[发明专利]一种猪瘟抗体检测试剂盒及制备方法

说明书

本发明公开了一种猪瘟抗体检测试剂盒及制备方法，所述试剂盒包括：包被板用抗原、抗原包被板、鼠抗猪瘟病毒单克隆抗体、羊抗鼠IgG‑HRP、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、洗涤液、TMB显色液和终止液，所述包被板用抗原为通过PEG浓缩、蔗糖密度梯度离心后纯化的猪瘟病毒。本发明采用通过PEG浓缩、蔗糖密度梯度离心后纯化的猪瘟病毒作为包被用抗原，以鼠抗猪瘟病毒单克隆抗体作为竞争性抗体，同时采用过氧化物酶标记的相对应种属的抗体作为标记抗体，建立猪瘟病毒抗体竞争ELISA检测方法，在提高猪瘟病毒抗体检测灵敏度的同时，大大提高了猪瘟病毒抗体检测的特异性。

技术领域

本发明属于生物制品领域，具体涉及一种猪瘟抗体检测试剂盒及制备方法。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性动物传染病，与牛病毒性腹泻病毒、羊边界病病毒同属于瘟病毒属。因其基因组序列与猪瘟病毒具有高度同源性，三者之间存在交叉抗原。因此，血清学上存在交叉反应。动物世界卫生组织将猪瘟列入A类传染病，我国也将其列为一类动物传染病。目前该病已经在许多国家和地区广泛传播，虽然有一些国家采用疫苗免疫和“扑杀”的方式来控制和消灭该病，但随着生态环境的改变，仍有猪瘟散发流行的报道。我国对于猪瘟的防控主要采用疫苗接种的预防措施，随着生猪及肉制品的内需增长，生猪的流通成为传播疾病的主要方式，使猪瘟病毒存在流行的风险。猪瘟病毒感染猪群后不但会严重影响猪群的健康，而且会导致较高的死亡率和不断向外排毒的风险，因此对猪群的健康评估以便及时了解猪群的感染及免疫情况成为防控该病的关键。

猪瘟病毒是RNA病毒，其编码区编码的多聚蛋白在加工、翻译过程中形成12种成熟的病毒蛋白。不同的蛋白在病毒的复制和基因的表达调控中均起着重要的作用。猪瘟病毒的功能性蛋白包括E^rns(但其诱导产生的中和抗体中和谱很窄)、E2蛋白(是猪瘟的保护性抗原蛋白，能携带刺激机体产生保护性免疫的抗原决定簇，诱导产生中和抗体。但E2蛋白拥有4个不同的抗原区域(A、B、C、D)，且大部分的区域都是极容易变异的(B、C、D))和NS3非结构蛋白。因此，仅仅依赖于单一的蛋白建立的检测方法难免会因蛋白抗原表位较为单一，导致检测的抗体就会相对单一，不能较好的反映病毒刺激机体以后的抗体总体水平。因此在进行该病的健康评估过程中难免会存在灵敏度低或漏检等情况。

目前，用于猪瘟病毒检测的血清学方法主要有免疫琼扩试验法、正向血凝试验法、猪瘟中和免疫荧光试验法等，这些方法在一定程度上都存在着结果判定人为误差影响较大，试验设备要求较高、难以满足批量化检测需求等缺陷，因此，临床上也很难得到推广应用。酶联免疫吸附试验是当前应用较为广泛的一种血清学检测技术，因其样本检测量大、灵敏度好和特异性高等特点而得到广泛的应用。但当前针对猪瘟抗体的检测方法主要集中于采用基因工程技术表达蛋白作为包被用抗原的方法，在抗体水平的检测上相对过于单一。虽然也有极少数报道采用猪瘟病毒作为检测用抗原，但其识别性抗体为血清多抗，容易引起不同程度的非特异性反应，造成假阴性、假阳性的出现。

针对猪瘟检测，一些学者建立了相应的血清学检测方法(如中国专利CN103882051B，一种检测猪瘟病毒抗体的ELISA方法及检测试剂盒，中国专利CN104483490B，一种猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒及应用)，但这些方法大多针对猪瘟病毒的某一单一蛋白做包被抗原，存在抗体识别相对较为单一、不能更好的反应整个猪瘟病毒在不同的感染时期血清中抗体水平的变化，也有学者采用猪瘟病毒的形式作为包被用抗原(如中国专利CN107064488B，一种猪瘟病毒血清总抗体固相阻断ELISA试剂盒所用抗原的制备方法)检测血清中的抗体水平，但其过氧化物酶标记物为多抗成分，因猪瘟病毒与牛病毒性腹泻病毒、羊边界病病毒同属于瘟病毒属，三者之间存在抗原及血清学上交叉反应。因此，采用羊抗猪瘟多抗进行过氧化物酶标记，在样品的测定过程中很难保证其竞争性结合仅为猪瘟病毒，增加了假阴性的概率，不利于自然感染猪群的筛查。

为了解决现有背景技术中存在的包被蛋白抗原过于单一，标记多抗难以排除相同病毒属非特异性交叉反应，猪瘟病毒纯化等问题，本发明主要从猪瘟病毒的纯化技术、鼠抗猪瘟单抗制备技术等方面解决当前遇到的难题。