[发明专利]一种柑橘全基因组KASP标记库的构建方法及应用

说明书

本发明提供一种柑橘全基因组KASP标记库的构建方法及应用，属于KASP标记库技术领域。所述柑橘KASP标记库的构建方法，包括如下步骤：导入群体父母本DNA样本以及杂交子代单株DNA样本；滤除样本中的偏分离位点；将过滤后的基因组VCF文件中的未知基因型数据进行基因型填充；对经填充的基因组VCF文件中的单碱基变异SNP数据进行过滤处理，得到最终基因组VCF文件；将最终基因组VCF文件导入KASP标记生成软件中，生成柑橘KASP标记库。本发明还公开了上述构建的柑橘KASP标记库的应用。本发明的KASP标记库可用于鉴定表型，具有高效、准确的优点。

技术领域

本发明主要涉及标记库构建技术领域，具体涉及一种柑橘全基因组KASP标记库的构建方法及应用。

背景技术

柑橘是世界上最重要的水果作物之一，我国柑橘年产量超过4000万吨，居世界首位。但柑橘的杂交育种进展一直缓慢，这是因为柑橘中具有独特的无融合生殖(Apomixis)现象。一方面多胚性状在柑橘生产中广泛利用，尤其是在砧木育种中通过无融合生殖产生的后代发芽和出苗率高、苗木均匀粗壮、整齐一致，是其它果树不具备的优点；另一方面，对杂交育种来说，受珠心胚干扰，导致杂交后往往得不到有性后代，严重影响了柑橘杂交育种效率。分子标记辅助育种在柑橘中有很大的利用价值，理论上利用分子标记可以在苗期鉴定出优良基因型的杂交种，能够提前预测表型，但是实际上有用的分子标记却很少。因此，选择高效的分子标记对于柑橘杂交育种及砧木育种是十分必要的。

近年来，随着分子生物学的发展，品种鉴定进入到基因水平。DNA标记技术具有准确、快速和自动化的特点，成本也在逐年下降，是未来品种鉴定的趋势，其中SSR和SNP是特别适用于品种鉴定的方法。SNP作为第三代分子标记有着诸多优势，也被认为是极具应用前景的分子标记技术。而KASP技术(Kompetitive Allele Specific PCR，即竞争性等位基因特异性PCR)是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels(Insertionsand Deletions，插入和缺失)，可在广泛的基因组DNA样品中(甚至是一些复杂基因组的DNA样品)，对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断，该技术具有高度稳定性与准确性的特点。作为一种高通量、低成本和低失误率的检测SNP分型方法之一，在作物辅助育种应用中具有重要作用。

SNP在基因组上广泛分布，密度大，类型多样，目前也有根据基因组开发SSR标记的方法，但是却没有全基因组KASP标记库的构建方法，因为测序和比对错误导致构建过程中具有较高的假阳性率，尤其是缺乏柑橘全基因组的KASP标记库的构建方法。

现有技术中，有两种获得基因组单一位点KASP标记方法：第一种是针对自然群体进行高通量测序，根据在小区间内标记连锁这个特征来筛选KASP标记，因为自然群体变异大，标记数量少，假阳性较高，往往配合关联分析来进行表型鉴定。第二种是针对遗传群体的父母本的进行重测序或者经过扩增之后进行PCR测序，重测序的方法标记中假阳性率极高，原因是：测序错误、比对准确性、变异检测误差。同时也没有一个标准去鉴定获得的标记的准确性，只能再去PCR扩增测序加以验证。

鉴于此，有必要提供一种柑橘全基因组KASP标记库的构建方法及应用，以解决现有技术的不足。

发明内容

本发明的目的之一，是提供一种柑橘全基因组KASP标记库的构建方法。本发明利用柑橘的遗传群体进行变异检测，并滤除偏分离位点，获得父母本在基因组上高度可信的变异位点信息，从而得到柑橘全基因组KASP标记库，该KASP标记库可用于鉴定表型，具有高效、准确的优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种柑橘全基因组KASP标记库的构建方法，包括如下步骤：

导入群体父母本DNA样本以及杂交子代单株DNA样本，所述群体父母本DNA样本和杂交子代单株DNA样本是通过微量DNA提取方法分别提取群体父母本以及多棵杂交子代单株得到的；